硒与猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP联合在增强猪巴氏杆菌疫苗免疫保护中的应用制造技术

一种硒与猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP联合在增强猪巴氏杆菌疫苗免疫保护中的应用，其中，该猪杀性巴氏杆菌抗原基因plpP的编码蛋白序列如SEQ ID NO：1所示，是利用反向疫苗学技术通过对猪源巴氏杆菌基因组全序列及其基因组各编码蛋白的结构和种类进行分析，筛选出的与多杀性巴氏杆菌免疫保护相关的候选抗原基因，经克隆、表达、纯化，得到表达量高的重组蛋白，并利用纯化后的重组蛋白进行动物免疫保护试验，初步验证了该候选抗原的强免疫原性和免疫保护作用，能用来制备猪巴氏杆菌疫苗；且该plpP蛋白与硒联合使用后，提高动物硒的摄取量可以增强猪巴氏杆菌疫苗的免疫保护效果。

【技术实现步骤摘要】
硒与猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP联合在增强猪巴氏杆菌疫苗免疫保护中的应用
本专利技术涉及抗原基因
，尤其涉及一种猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP与硒联合的作用，具体涉及在提高动物硒的摄取量后，硒与猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP联合可以增强猪巴氏杆菌疫苗的免疫保护效果。
技术介绍
猪巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)引起的猪的细菌性传染病。多杀性巴氏杆菌属革兰氏阴性菌，对人和多种动物均有致病性，可引起猪肺疫、牛羊出败、禽霍乱等危害严重的畜禽传染病。该病原菌还可与多种病原协同感染，从而增加猪群呼吸道疾病的发病率和死亡率，造成严重的经济损失。另外，产毒素多杀性巴氏杆菌是猪传染性萎缩性鼻炎的主要病原菌，该病主要表现为慢性鼻炎、颜面部变形和鼻甲骨萎缩等症状。目前，在我国许多省、市区有不同程度的发生和流行，对养猪业的危害日趋严重。目前，猪巴氏杆菌病的免疫预防方法是注射多杀性巴氏杆菌疫苗(为基因工程重组亚单位疫苗)。硒作为一种必需微量元素，对免疫系统有着很重要的作用，能增强机体的免疫力。增加硒的摄入可以增强细胞免疫和体液免疫，而硒缺乏时则表现出动物对病毒、细菌以及肿瘤等免疫抵抗降低。硒不仅仅是免疫器官和免疫细胞的营养元素，它与免疫功能之间的关系非常复杂。虽然基因工程重组亚单位疫苗有许多优点：如成本低廉、安全性高、性能稳定和易于大规模生产等，但由于亚单位疫苗只是利用细菌病原的一个或少数几个保护性抗原，其刺激的免疫强度往往不如全菌苗。基于硒普遍的免疫促进作用，本专利技术在验证猪巴氏杆菌保护抗原的基础上，选择免疫保护作用较好的重组抗原，提高动物硒的摄取量，尝试该候选抗原与硒的联合作用以探讨通过营养调控提高基因工程重组抗原的免疫保护的可行性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种硒与猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP联合对猪巴氏杆菌疫苗免疫保护的增强作用。为达上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种硒与猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP联合在增强猪巴氏杆菌疫苗免疫保护中的应用，其中，该猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP的编码蛋白序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术同时提供一种硒与猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP联合在营养调控提高猪巴氏杆菌疫苗的免疫保护效果中的应用，其中，该猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP的编码蛋白序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术利用反向疫苗学技术通过对猪源巴氏杆菌基因组全序列及其基因组各编码蛋白的结构和种类进行分析，初步挖掘出与多杀性巴氏杆菌免疫保护相关的候选抗原基因plpP，并经克隆、表达、纯化得到表达量高的重组蛋白，并利用纯化后的重组蛋白进行动物免疫保护试验，初步验证了该候选抗原的强免疫原性和免疫保护作用；并初步探讨了该候选抗原单独免疫或在提高动物每天硒摄取量的条件下的免疫原性以及免疫保护效果，发现在硒摄取量达3.4μg/只/天(1.6μg来源于饲料，1.8μg来源于补充)时即硒的需求量增加到为正常需求量的一倍时，免疫plpP抗原的小鼠的免疫保护作用得到了提高，为营养调控提高猪巴氏杆菌疫苗的免疫保护效果提供了可行性。附图说明图1是本专利技术plpP基因的扩增电泳图。其中，M：Marker，1：plpP基因。图2是阳性质粒的PCR鉴定电泳图。其中，M：Marker，1、2：重组质粒。图3是重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。其中，M：蛋白分子Marker；1-4：分别是用500mM咪唑洗涤收集后的蛋白样品，5：用50mM咪唑洗涤收集的蛋白样品。图4是硒与候选抗原联合作用对小鼠的保护作用图。其中，A：plpP抗原二免后对小鼠的保护作用；B：低硒与plpP抗原联合；C：中硒与plpP抗原联合；D：高硒与plpP抗原联合。具体实施方式实施例1猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP的体外克隆、表达从GenBank中下载猪巴氏杆菌A型3480和D型HN06的全基因组序列，对它们的全基因组注释进行分析，查找出具有潜在免疫保护性的蛋白，并对该些蛋白的基因进行同源比较分析，选择在两组序列中同源性高的基因的蛋白进行序列分析(包括信号肽预测、跨膜区域预测、蛋白结构预测、酶切位点预测等)，筛选得到猪多杀性巴氏杆菌候选抗原基因plpP，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，其编码的蛋白序列如SEQIDNO：1所示。1.目的基因的扩增与纯化根据所获得的plpP基因序列设计引物，正向引物：5’-cgcgaattcatgggcggaaacaatgcgcctcc-3’(SEQIDNO：3),反向引物：5’-cgcgtcgactttattcgtctgtttttctgctgg-3’(SEQIDNO：4)，预期目的片段大小为936bp。引物由上海博尚生物技术有限公司合成。将合成的引物用高压灭菌的超纯水稀释至100pmol/L，以DNA为模板，PCR扩增候选抗原基因plpP，扩增反应体系为100μL：2×PCRMix50μL、上游引物5μL、下游引物5μL、DNA模板5μL、超纯水35μL；反应条件：94℃5min；95℃30s，61℃45s或90s，72℃30s，30循环；72℃7min。扩增得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后用美国Axygen公司PCR产物回收试剂盒回收，见图1，结果显示，扩增获得的片段大小与预期的扩增片段大小一致。2.质粒的构建将pET-28a(+)载体(购自Novagen)和PCR产物分别用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切，然后将合成的融合基因克隆到pET-28a(+)载体中。pET-28a(+)载体的酶切体系(50μL)：10×Buffer5.0μL、EcoRⅠ2.0μL、SalⅠ2.0μL、pET-28a(+)载体2.0μL、超纯水39.0μL。37℃中水浴反应2h，琼脂糖电泳进行酶切鉴定，将酶切好的载体进行胶回收。用T4DNA连接酶将合成的融合基因与回收载体酶切产物进行连接。连接反应体系10μL：10×T4Buffer1.0μL、T4DNA连接酶0.8μL、扩增的基因片段(约50ng)0.5μL、酶切的pET-28a(+)载体(50-100ng)1.2μL、超纯水5.5μL。16℃水浴中反应过夜。采用热激法将连接产物转化至DH5α感受态细胞，提取重组质粒进行阳性鉴定，见图2，目的条带大小与预期片段大小一致。3.候选抗原的体外表达及纯化将鉴定为阳性的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单克隆菌接种至5ml含卡拉霉素(Kan，0.1％)的LB培养基中，37℃震荡培养过夜；按1:100的体积将细菌转接至LB培养基中，当OD650至0.6-0.8时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导培养4.5h；诱导表达后，离心(8000rpm/min，10min)收集菌液，用PBS洗菌后离心集菌；按每1-2克菌体加10mL破碎缓冲液(pH8.550mMTris-HCl,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5％TritonX-100,1mg/ml溶菌酶)，冰上预混45min；每间隔2min超声破碎20s，重复1次冷却处理破碎；将破碎液于4℃，12000g离心10min，收集上清和沉淀；取10μL上清，加入10μL2×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸处理3min后进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种硒与猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP联合在增强猪巴氏杆菌疫苗免疫保护中的应用，其中，该猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP的编码蛋白序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种硒与猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP联合在制备免疫保护增强的猪巴氏杆菌疫苗中的应用，其中，该猪多杀性巴氏杆菌抗原基因plpP所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍小松，余兴龙，苏丁丁，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43