本发明专利技术公开了一种基于数字PCR平台的miRNA‑122检测试剂盒及miRNA‑122在制备评估肝移植损伤试剂盒中的应用。本发明专利技术提供的试剂盒的反转录缓冲液和PCR缓冲液不但在组分上进行了优化有利于长期稳定保存，同时可将加样工作量简化至最小，以减少加样时可能出现的失误或误差，有利于得到稳定可靠的检测结果；本发明专利技术试剂盒在反转录茎环引物和检测引物序列的设计上进行了碱基修改和优化，相比传统常用的miRNA反转录茎环引物和检测引物，在用于数字PCR平台检测时结果更好更稳定；本发明专利技术miRNA‑122作为独立的分子标记物，经过临床验证试验，将上述miRNA检测试剂盒的开发实现了作为分子标志物在制备评估肝移植损伤试剂盒中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于数字PCR平台的miRNA-122检测试剂盒及其应用。
技术介绍
肝移植是挽救各种终末期肝功能衰竭或损坏病人生命的最有效手段。在移植术后，临床常常采用穿刺针等侵入性诊断方法进行肝移植物的损伤及排斥情况检测，不仅花费昂贵，且由于检测标志物的变化往往发生在生理病变中晚期，缺乏足够的灵敏度，同时还伴随有高并发症的风险，因此难以作为长期监控移植排斥的手段。MicroRNA(miRNA)是真核生物中广泛存在的一种长约22个核苷酸的非编码小RNA分子，其对细胞发育、分化、增殖和凋亡至关重要，调控并影响了整个生命活动的过程。大量研究已证实，miRNA-122在人体中的表达具有高丰度和高器官组织特异性，大量表达于人体肝脏。当肝细胞受损死亡后，其会释放并稳定存在于人体外周血中，因此可作为评估肝移植损伤的有效靶分子。微滴式数字PCR(Droplet DigitalTM PCR)被称为第三代PCR技术，由于在人体例如血浆、尿液等体液中的miRNA分子丰度普遍不高，而数字PCR由于其在微量检测技术上的重大创新和突破，目前已成为液体活检中认知度最高的技术手段。如何将肝移植损伤的基础研究领域的成果迅速应用于临床，需要精确核准检测的最有效分子标记物，并建立快捷简便的应用体系，引导相关产品开发。经检索，目前还没有一种方便快捷的基于数字PCR平台的miRNA-122检测的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种基于数字PCR平台的miRNA-122检测试剂盒及其应用。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：miRNA-122在制备评估肝移植损伤试剂盒中的应用，其中miRNA-39作为内参。一种基于数字PCR平台的miRNA-122检测试剂盒，它包括反转录缓冲液、反转录酶、PCR缓冲液、超纯水、阳性对照和阴性对照，所述反转录缓冲液包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的反转录引物；所述PCR缓冲液包括核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的检测上引物和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的检测下引物，所述阴性对照为miRNA-39，所示阳性对照为miRNA-122。进一步地，所述miRNA-39的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。进一步地，所述miRNA-122的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。进一步地，所述反转录缓冲液的体积为9μl，所述反转录酶的体积为1μl，所述PCR缓冲液的体积为17μl，所述超纯水的体积为20μl，所述阳性对照的体积为3μl，所述阴性对照的体积为3μl。进一步地，所述反转录缓冲液包括dNTPs、10×RT Buffer、RNase inhibitor、反转录引物和超纯水。进一步地，所述反转录缓冲液包括浓度为100mM的dNTPs0.15μl、10×RT Buffer1.5μl、浓度为10mg/ml的RNase inhibitor 0.2μl、浓度为10μm的反转录引物1μl和超纯水6.15μl。进一步地，所述PCR缓冲液包括2×PCR Buffer、检测上引物、检测下引物和超纯水。进一步地，所述PCR缓冲液包括2×PCR Buffer 10μl、浓度为10μm的检测上引物0.5μl、浓度为10μm的检测下引物0.5μl和超纯水6μl。本专利技术所述的反转录酶为ABI公司的MultiScribeTM Reverse Transcriptase,，浓度为50U/μL。本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术提供的试剂盒的反转录缓冲液和PCR缓冲液不但在组分上进行了优化有利于长期稳定保存，同时可将加样工作量简化至最小，以减少加样时可能出现的失误或误差，有利于得到稳定可靠的检测结果；(2)本专利技术试剂盒在反转录茎环引物和检测引物序列的设计上进行了碱基修改和优化，相比传统常用的miRNA反转录茎环引物和检测引物，在用于数字PCR平台检测时结果更好更稳定；(3)本专利技术miRNA-122作为独立的分子标记物，经过临床验证试验，将上述miRNA检测试剂盒的开发实现了作为分子标志物在在制备评估肝移植损伤试剂盒中的应用。附图说明图1为本专利技术试剂盒检测血浆中miRNA-122含量的数字PCR结果图；图2为本专利技术试剂盒使用引物与传统引物在数字PCR平台中检测结果的比较图。具体实施方式下面结合附图及实施例对本专利技术做进一步的描述，本专利技术的保护范围不局限于以下所述。实施例1：试剂盒的组成一种基于数字PCR平台的miRNA-122检测试剂盒，它包括反转录缓冲液9μl、反转录酶1μl、PCR缓冲液17μl、超纯水20μl、阳性对照3μl和阴性对照3μl，所述反转录缓冲液包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的反转录引物，序列为：5’-GTCGTATCCAGTGCCACACGTCCTCGAGGCTTAAGCACTGGATACGACCAAACACC-3’；所述PCR缓冲液包括核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的检测上引物和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的检测下引物，检测上引物的序列为5’-ATGGCTGGAGTGTGACAATGG-3’，检测下引物序列为5’-GTATCCAGTGCCACACGTCCTC-3’；所述阴性对照为合成的线虫来源约850copies/ul的miRNA-39，所述miRNA-39的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，序列为5’-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’；所示阳性对照为合成的人源约850copies/ul的miRNA-122序列，所述miRNA-122的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，序列为5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’。所述反转录缓冲液包括浓度为100mM的dNTPs0.15μl、10×RT Buffer1.5μl、浓度为10mg/ml的RNase inhibitor 0.2μl、浓度为10μm的反转录引物1μl和超纯水6.15μl。所述PCR缓冲液包括2×PCR Buffer 10μl、浓度为10μm的检测上引物0.5μl、浓度为10μm的检测下引物0.5μl和超纯水6μl。本专利技术所述的反转录酶为ABI公司的MultiScribeTM Reverse Transcriptase,，浓度为50U/μL。实施例2：反应体系及反应条件1.miRNA-122反转录体系如表1所示：表1：miRNA-122反转录体系成分体积反转录缓冲液9ul反转录酶1ulRNA样品(总量5～50ng)5ul共计15ul2.miRNA-122反转录反应条件如表2所示：表2：miRNA-122反转录反应条件步骤时间温度130min16℃230min42℃35min85℃4Forever4℃3.miRNA-122检测反应体系如表3所示：表3：miRNA-122检测反应体系成分体积PCR缓冲液17ul反转录样品3ul共计20ul4.miRNA-122检测反应条件如表4所示：表4：miRNA-122检测反应条件待所有反应完成后，用Bio-Rad的QX200TM微滴式数字PCR仪进行结果读取。实施例3：检测肝移植术后病人血浆中的miRNA-122的表达水平1.样本采集及处理使用普通EDTA采本文档来自技高网...
【技术保护点】
miRNA‑122在制备评估肝移植损伤试剂盒中的应用。
【技术特征摘要】
1.miRNA-122在制备评估肝移植损伤试剂盒中的应用。2.miRNA-122在制备评估肝移植损伤试剂盒中的应用，其中miRNA-39作为内参。3.一种基于数字PCR平台的miRNA-122检测试剂盒，其特征在于，它包括反转录缓冲液、反转录酶、PCR缓冲液、超纯水、阳性对照和阴性对照，所述反转录缓冲液包括核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的反转录引物；所述PCR缓冲液包括核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的检测上引物和核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的检测下引物，所述阴性对照为miRNA-39，所示阳性对照为miRNA-122。4.如权利要求3所述的一种基于数字PCR平台的miRNA-122检测试剂盒，其特征在于，所述miRNA-39的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。5.如权利要求3所述的一种基于数字PCR平台的miRNA-122检测试剂盒，其特征在于，所述miRNA-122的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。6.如权利要求3所述的一种基于数字PCR平台的miRNA-122检测试剂盒，其特征在于，所述反转录缓冲液的体积为9μl，所述反转录酶的体积为1μl，所述PCR缓冲液...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏亮，卢俊，杨洪吉，
申请(专利权)人：成都仕康美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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