本发明专利技术公开了包含促红细胞生成素(EPO)和含有两个单甲氧基聚乙二醇(mPEG)分枝的不对称支化聚合物结构的缀合物，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之间，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之间；以及公开了包含该缀合物的药物组合物。本发明专利技术还提供了用于获得经PEG化的EPO的方法，其特征在于，将所述蛋白质缀合至具有两个有着上述分子量的mPEG分枝的不对称支化聚合物结构。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物技术、生物科学和制药工业领域，特别地涉及对分子进行修饰以便改善其药物代谢动力学，其中增加其在血液中的半衰期和其生物学活性。现有技术近年来，生物分子用于在人类中的治疗用途的使用有所增加，这主要是由于：(1)发现了新的蛋白质和肽分子，(2)对于体内作用机制有了更好的理解，(3)改善了蛋白质的表达系统和肽的合成，和(4)改善了制剂或分子修饰技术，其使得能够改善药效动力学和药物代谢动力学特性。在药物的修饰释放领域中的技术发展已经使得能够引入许多改变可注射药物的释放的系统，以便改善治疗剂的药效动力学和药物代谢动力学特性。新的药物释放系统可以通过制剂的变化(例如，持续释放产品或脂质体)或者通过向药物分子进行添加(例如，PEG化，其仅为将药物共价结合至一个或多个聚乙二醇(PEG)分子)来产生。新的释放形式导致半衰期的增加、副作用的减少、药物功效的提高以及患者的更好的生活质量。持续释放系统以受控的且预定的方式释放药物，并且尤其适合于其中避免在血浆中的浓度大幅波动是重要的那些药物。由于保护了对于降解敏感的蛋白质以及经延长或经修饰的释放，已经广泛地研究了通过使用生物可降解的微球来进行的分子的全身性释放(Sinha，V.R.和Trehan，A.(2003).Biodegradable microspheres as protein delivery，J.Controlled Release，90(3)：261-280)。PEG化提供了一种用于修饰治疗性蛋白质以使生物分子的许多药理学限制最小化的方法。例如，在血液中的半衰期由于数个原因而增加，其中包括：聚合物残基可以阻止蛋白酶的攻击以及该药物被免疫系统识别，以及所述缀合物的相对于天然蛋白质而言显著更大的流体动力学体积使得肾滤过明显地减少。虽然在许多情况下蛋白质的体外生物学活性受到PEG化影响，但是在血液中的寿命的重大增加使得其治疗作用是更有效的(Harris J.M.和Chess R.B.(2003)Effect of pegylation on pharmaceuticals.Nat.Rev.Drug Discov.2：214-221)。PEG化的另一个益处为物理稳定性的增加，这是由于其在空间上阻断由疏水相互作用所诱导的降解途径，并且产生减少在所述蛋白质的热不稳定性中所牵涉的分子间相互作用的非特异性空间障碍。物理稳定性的增加使得能够获得更稳定的制剂(Harris J.M.和Chess R.B.(2003)Effect of pegylation on pharmaceuticals.Nat. Rev.Drug Discov.2：214-221)。由于第二代经活化的PEG的出现，能够拥有允许更有选择性的PEG化的基团(例如：优先结合蛋白质的N-末端的醛基团)和支化结构(Roberts M.J.，Bentley M.D.，Harris J.M.(2002)Chemistry for peptide and protein PEGylation.Adv.Drug Deliv.Reviews.54：459-476)。所开发出的支化PEG包括具有两个分枝的单官能PEG(专利号US 5,932,462)、具有四个分枝的四官能PEG和具有八个分枝的八官能PEG。关于治疗性蛋白质的缀合，更有用的经活化的PEG为单官能PEG，因为其避免该蛋白质与该PEG聚合物之间的交联。支化PEG还具有伞型效应，其允许更好的对于蛋白质表面的保护。具有两个分枝的单官能PEG使得能够获得与干扰素α-2a的缀合物，其显示出在临床上比天然蛋白质更好的结果(Rajender Reddy K.，Modi M.W.，Pedder S.(2002).Use of peginterferon alfa-2a(40KD)(Pegasys)for the treatment of hepatitis C.Adv.Drug Deliv.Reviews.54：571-586)。存在有关于许多其中应用了不同的修饰释放技术的蛋白质的报道，其中包括重组的人促红细胞生成素(EPO)(rh EPO)。EPO为具有165个氨基酸的糖蛋白。取决于其糖基化程度，通过使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(缩写为SDS-PAGE)而估计的它的分子量在27kDa和39kDa之间变化(Mikaye，T.等人，(1977).Purification of Human erythropoietin.J.Biol.Chem.252：5558-5564)。在调查研究中已证明，通过撤除低氧刺激，在血液中EPO的信使核糖核酸(mRNA)快速减少，其中可能在3小时时无法检测，这表明其半衰期是短的(Lacombe，C.等人，(1988)Peritubular cells are the site of erythropoietin synthesis in the murine hypoxic kidney.J.Clin.Invest.81：620-623；Koury，S.T.等人，(1989)Quantitation of erythropoietin producing cells in kidneys of mice by in situ hybridation：Correlation with hematocrit，renal erythropoietin mRNA and serum erythropoietin concentration.Blood 74：645-651)。据估计，EPO在血浆中的半衰期在4小时和13小时之间变化；当与其他具有治疗用途的分子相比较时，该时间是非常短的。这使得需要有规律地使用该激素的患者必须频繁地注射以维持接近正常水平的红细胞水平(Spivak，J.L.1992.The mechanism of action of erythropoietin：Erythroid cell response.J.W.Fisher(Ed.)Biochemical Pharmaeology of Blood and Blood-Forming Organs.Springer-Verlag Berlin.Handbook of Experimental Pharmacology.101：49-114；Jelkmann，W.(1986).Renal Erythropoietin：Properties and Production.Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.104：139-205)。为了增加rh EPO的半衰期，对该分子进行了突变以增加N-糖基化位点(Burke，Paul(2003).Device for the sustained release of aggregation-stabilized，biologically active agent.美国专利申请号20030133979)，它被包囊在微球(Morlock M.等人，(1998).Erythropoietin loaded microspheres prepared from biodegradable LPLG-P本文档来自技高网...
【技术保护点】
包含促红细胞生成素(EPO)和含有两个单甲氧基聚乙二醇(mPEG)分枝的不对称支化聚合物结构的缀合物，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之间，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之间。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.08 CU CU-2014-00031.包含促红细胞生成素(EPO)和含有两个单甲氧基聚乙二醇(mPEG)分枝的不对称支化聚合物结构的缀合物，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之间，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之间。2.根据权利要求1的缀合物，其中所述mPEG分枝之一的分子量为12kDa，和另一mPEG分枝的分子量为20kDa。3.根据权利要求1的缀合物，其中所述不对称支化聚合物结构如下所示：4.根据权利要求3的缀合物，其中mPEG1的分子量为12kDa且mPEG2的分子量为20kDa，或者mPEG1的分子量为20kDa且mPEG2的分子量为12kDa。5.根据权利要求1-4中任一项的缀合物，其中所述EPO为重组的人EPO(rhEPO)。6.药物...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·派斯梅雷莱斯，D·E·阿马罗冈萨雷斯，F·R·卡斯特罗奥迪奥，Y·埃尔南德斯瓦尔德斯，G·A·鲁伊斯埃斯特拉达，
申请(专利权)人：遗传工程与生物技术中心，分子免疫中心，
类型：发明
国别省市：古巴;CU
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