一种斜生栅藻藻株及其培养方法和应用技术

一种斜生栅藻藻株SoHNCJ2的分离纯化方法，将采集的水样稀释后均匀涂布在1.5‑2%琼脂的BG11培养基平板上，放置在培养箱中进行连续光照培养；待平板上长出单藻落后，用牙签挑取单藻落在BG11平板上划短线培养；再将所得划短线培养的藻种用接种针划Z型线进行藻种的分离和除菌，然后用稀释涂平板的方法进一步纯化藻种；挑取单藻落划短线和挑取短线藻落划Z线交替进行2～4次后得到纯净的单一藻落。一种斜生栅藻藻株SoHNCJ2的培养方法，将淡水蓝藻培养基BG11的N或P浓度降低到原来的1/4或增加到原来的三倍，即采用1/4 N或3倍N、P浓度的BG11培养基。本发明专利技术的斜生栅藻能够在较低浓度的N源条件下持续快速生长，藻细胞能够有效积累大量油脂，可进行转脂化生产生物柴油。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物和生物能源领域，尤其是涉及一种斜生栅藻藻株及其分离纯化、培养、收集方法及其用途。
技术介绍
随着社会经济的日益繁荣，人类可利用资源日渐枯竭，为了社会的可持续发展，当今世界各国政府及有关技术人员逐渐将研究方向转向了可再生能源。因为地球上的藻类资源物种丰富，其中不乏富油藻种。因此从油藻中提取油脂用于生物柴油的生产，以代替日渐枯竭的石油来源，成为科学界十分关注的课题。而现有技术已有富油藻类的培养提取方法及其有关应用公开，但对于其丰富应用而言，仅仅是九牛一毛。因此，对这类技术的研究仍在不断地持续深入和扩大中，尚有大量的富油藻类物种，需要去发现，需要去实现有效的培养和分离，需要去进行深入的应用研究。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术不足，提出了一种斜生栅藻藻株的分离纯化和培养方法，并对其应用进行了研究。从野外采集水样，通过培养、分离、纯化得到一种斜生栅藻藻株SoHNCJ2（Scenedesmus obliquus），并进行了保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2016253，分类命名: Scenedesmus obliquus SoHNCJ2,保藏日期为2016年5月6日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心,地址：中国.武汉.武汉大学。本专利技术所采用的技术方案：一株斜生栅藻藻株SoHNCJ2，其保藏编号为CCTCC NO：M2016253， 保藏日期为2016年5月6日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。一种如上所述的斜生栅藻藻株SoHNCJ2的分离纯化方法，1)将采集的水样稀释后均匀涂布在1.5-2％琼脂的BG11培养基平板上，放置在培养箱中进行连续光照培养；2)待平板上长出单藻落后，用牙签挑取单藻落在BG11平板上划短线培养；3)再将所得划短线培养的藻种用接种针划Z型线进行藻种的分离和除菌，然后用稀释涂平板的方法进一步纯化藻种；4)挑取单藻落划短线和挑取短线藻落划Z线交替进行2～4次后得到纯净的单一藻落；所述培养基采用淡水蓝藻培养基BG11。一种如上所述的斜生栅藻的培养方法，将淡水蓝藻培养基BG11的N浓度降低到原来的1/4，即采用1/4N浓度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如下：NaNO3，0.375gK2HPO4，0.04gMgSO4.7H2O，0.075gCaCl2.7H2O，0.036gNa2CO3，0.02g柠檬酸，0.006g柠檬酸铁，0.006g微量元素溶液，A5 1mL采用蒸馏水定容至1000mL。一种如上所述的斜生栅藻的培养方法，将淡水蓝藻培养基BG11的N浓度增加到原来的三倍，即采用3N浓度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如下：NaNO3，4.5gK2HPO4，0.04gMgSO4.7H2O，0.075gCaCl2.7H2O，0.036gNa2CO3，0.02g柠檬酸，0.006g柠檬酸铁，0.006g微量元素溶液，A5 1mL采用蒸馏水定容至1000mL。一种如上所述的斜生栅藻的培养方法，将淡水蓝藻培养基BG11的P浓度增加到原来的三倍，即采用3P浓度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如下：NaNO3，1.5gK2HPO4，0.12gMgSO4.7H2O，0.075gCaCl2.7H2O，0.036gNa2CO3，0.02g柠檬酸，0.006g柠檬酸铁，0.006g微量元素溶液，A5 1mL采用蒸馏水定容至1000mL。所述的斜生栅藻的培养方法，使藻株在温度15～40℃，光强500～2500lux，pH7-9的条件下生长，培养至对数生长后期，藻细胞在6～12h内完全自然沉降，倒出上层的培养基，即得到高浓度的藻液。所述的斜生栅藻藻株SoHNCJ2，其在1/4N BG11培养基中大量培养，生长不受影响，油脂含量最高，获得的含油藻细胞在转脂化生产生物柴油中的应用。所述的斜生栅藻藻株SoHNCJ2，其大量培养获得的斜生栅藻SoHNCJ2的多不饱和脂肪酸含量较高，用于动物饲料的添加。所述的斜生栅藻藻株SoHNCJ2，其在3N和3P培养基中生长不受影响，其培养方法在有机污染污水处理中的应用。本专利技术的有益效果：1、本专利技术的斜生栅藻能够在较低浓度的N源条件下持续快速生长，节约成本。在较低N浓度条件下，藻细胞能够有效积累大量油脂，能够进行转脂化生产生物柴油。2、本专利技术斜生栅藻藻株SoHNCJ2的培养方法，藻细胞能够在6～12h内自然沉降，无需添加絮凝剂，收集方法简单，节约成本，减少对环境的污染。3、本专利技术斜生栅藻藻株SoHNCJ2的培养方法，藻细胞内油脂中多不饱和脂肪酸含量高，能够作为动物饲料的直接营养添加剂。4、本专利技术斜生栅藻藻株SoHNCJ2的培养方法，应用于有机污染污水处理，具有一定的水体净化效果，可以降低水体的富营养化。因为栅藻对有机污染物具有较强的耐性，因此可在培养基中添加一定比例的有机污染污水，既净化水体，又减少成本。附图说明图1是本专利技术分离纯化的藻细胞在高倍显微镜下的藻细胞形态示意图；图2是本专利技术分离纯化的藻株16SrDNA序列的进化树分析；图3是本专利技术分离纯化藻株在不同N浓度下的生长曲线；图4是本专利技术分离纯化藻株大量培养后自然沉降示意图；图5是本专利技术分离纯化的斜生栅藻在高N、P浓度中的生长曲线。具体实施方式实施例1一株斜生栅藻藻株SoHNCJ2，其保藏编号为CCTCC NO：M2016253， 保藏日期为2016年5月6日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。实施例2一种斜生栅藻藻株SoHNCJ2的分离纯化方法，包括如下步骤：1)从平顶山市新城区平西湖水库多点采集水样，将采集的水样稀释后均匀涂布在1.5～2％琼脂的BG11培养基平板上，放置在培养箱中进行连续光照培养；2)待平板上长出单藻落后，用牙签挑取单藻落在BG11平板上划短线培养；3)再将所得划短线培养的藻种用接种针划Z型线进行藻种的分离和除菌，然后用稀释涂平板的方法进一步纯化藻种；4)挑取单藻落划短线和挑取短线藻落划Z线交替进行2～4次后得到较为纯净的单一藻落。培养基采用淡水蓝藻培养基BG11。分离纯化的斜生栅藻藻株SoHNCJ2的鉴定方法： 1)藻细胞形态鉴定：藻细胞在在1000倍光学显微镜下进行观察，藻细胞形态见图1所示：藻细胞黄绿色，呈卵圆形，多为2个细胞成对排列，细胞壁平滑，细胞两端具弯曲的长刺，细胞内有大量颗粒物，色素体周生，具1个蛋白核。单个细胞大小：长6-8um，宽2-3um，初步鉴定为栅藻。2)16S rDNA分子鉴定：采用CTAB法提取基因组DNA，方法如下：先将2×CTAB在65度预热备用；12000rpm离心收集1.5mL或更多的生长至对数后期的藻细胞于eppendorf管中；破细胞，加入约100μL的2×CTAB及少量石英砂涡旋震荡，再加入约300μL预热的2×CTAB，置于65度温浴0.5-2h；待冷却至室温，加入400μL氯仿：异戊醇(24：1)，颠倒混匀乳浊状，12000rpm离心10min，上清转入新的eppendorf管中，加入1/5体积的5M NaCl和2倍体积的无水乙醇，混匀后-20度沉降。12000rpm离心10min，弃上清，得到的沉淀加入500μL 70％的乙醇，离心3min，弃上清。得到的总DNA在超净台晾本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株斜生栅藻藻株SoHNCJ2，其保藏编号为CCTCC NO：M2016253， 保藏日期为2016年5月6日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

【技术特征摘要】
1.一株斜生栅藻藻株SoHNCJ2，其保藏编号为CCTCC NO：M2016253， 保藏日期为2016年5月6日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。2.一种如权利要求1所述的斜生栅藻藻株SoHNCJ2的分离纯化方法，其特征在于：1）将采集的水样稀释后均匀涂布在1.5-2%琼脂的BG11培养基平板上，放置在培养箱中进行连续光照培养；2）待平板上长出单藻落后，用牙签挑取单藻落在BG11平板上划短线培养；3）再将所得划短线培养的藻种用接种针划Z型线进行藻种的分离和除菌，然后用稀释涂平板的方法进一步纯化藻种；4）挑取单藻落划短线和挑取短线藻落划Z线交替进行2～4次后得到纯净的单一藻落；所述培养基采用淡水蓝藻培养基BG11。3.一种如权利要求1所述的斜生栅藻的培养方法，其特征在于：将淡水蓝藻培养基BG11的N浓度降低到原来的1/4，即采用1/4 N浓度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如下：NaNO­3，0.375gK2HPO4，0.04gMgSO4.7H2O，0.075gCaCl2.7H2O，0.036gNa2CO3，0.02g柠檬酸，0.006g柠檬酸铁，0.006g微量元素溶液，A5 1 mL采用蒸馏水定容至1000 mL。4.一种如权利要求1所述的斜生栅藻的培养方法，其特征在于：将淡水蓝藻培养基BG11的N浓度增加到原来的三倍，即采用3N浓度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如下：NaNO­3，4.5gK2HPO4，0.04gMgSO4.7H2O，0....

【专利技术属性】
技术研发人员：王赟，柯飞，王红强，屈二军，梁峰，杨雨彬，
申请(专利权)人：河南城建学院，王赟，
类型：发明
国别省市：河南;41