本发明专利技术公开了一种快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-RPA检测试剂盒及其用途。所述试剂盒包括有一对引物和一条探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示。实验证明本发明专利技术的试剂盒能够特异性的检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)，与猪瘟病毒、C型-猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪2型圆环病毒、猪伪狂犬病毒以及口蹄疫病毒等不反应。实验证明，本发明专利技术的试剂盒能够在40℃，扩增20min的条件下检出最少70个拷贝的模板，且与RT-qPCR具有很高的符合度。由此说明，本发明专利技术的试剂盒能够快捷、高效、灵敏的检测HP-PRRSV，本发明专利技术的提出为HP-PRRSV的鉴别诊断提供了有效技术手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及其用途，特别 涉及一种快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-RPA检测试剂盒及其用途，本发 明属于预防兽医学检验领域。
技术介绍
在发展中国家实验室中，由于PCR实施所需要的基础设备和技术所限，大多数发展 中国家仍然集中在使用传统的试验方法，比如血清学方法、显微镜技术，或者培养以及鉴定 传染性以及非传染性疾病。在大多数情况下，尽管缺少使用这些方法的实验设备，并且缺乏 综合管理这些疾病的常规操作。因此，这些国家长期持续的受到这些疾病的困扰，包括艾滋 病、麻疹以及肺结核病，以及2014年爆发的埃博拉病。为了填补传统方法和PCR之间的空缺， 新的等温分子诊断技术正在陆续被开发，这些方法尤其适用于基础设施、实验设备以及试 验技术难于支持使用PCR进行诊断的地方。与常规方法相比较，这些方法具有很高的敏感性 和特异性，因而促使不同的公司对这些等温扩增技术商业化，比如，环介导的扩增（LAMP; Eiken,日本），RPA(RPA;Alere,USA and TwistDx，UK)，链置换扩增（strand displacement amplification，Becton Dickson,USA) ΙΑΜΡ技术已经比较成熟，并且得到广泛使用，到目 前为止，已经超过1000份关于LAMP在不同疾病诊断中应用的科研文章，可是，该技术距离在 发展中国家应用仍然有较大的距离，而且该技术也有不足的地方，比如试验设计比较麻烦 (3对引物），特异性相对较弱(能扩增很多条带），时间仍然相对较长，以及易于污染等。 重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可 以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司TwistDx Inc开发）。不像其他的等温扩增方法，RPA 扩增能够以非常快的速度(20分钟以内）扩增出DNA/RNA，该扩增可以在人体温温度下，或者 更低的温度下进行。RPA扩增可以使用所有的基于PCR的扩增检测，尤其是实时荧光检测以 及试纸条检测。RPA已经被英国剑桥的Twist DX商业化，商业化的试剂盒以一种冻干的形式储 存，以便于在条件差的环境下使用，可以根据使用者设计的特异引物和探针来进行特异的 扩增，目前该公司提供了商业化的弯曲杆菌、红绸鱼、李斯特菌以及沙门氏菌检测试剂盒。 RPA技术自2006年问世以来，快速的冲击着田间分子检测市场，目前该技术已经被广泛的应 用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业上，比如用于检测土拉弗朗西斯菌、细螺旋体、 HIV-1DNA、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、天花病毒、B型链球菌、大肠杆菌产生的志贺毒素、中东呼吸 综合征冠状病毒、裂谷热病毒、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病 毒、施马伦贝格病毒、牛病毒性腹泻病毒、黄热病毒以及戈登病毒等病原。 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)俗称"猪蓝耳"，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重损害全世界养 猪业的重要的疾病，其主要临床症状为母猪繁殖失败以及仔猪呼吸系统疾病。该病分别于 1987年和1990年出现在美国中西部和中欧，之后很快广泛流行于北美、欧洲等养猪国家和 地区。1991年荷兰和美国的调查者鉴定出PRRSV是猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)的病原。 PRRSV是一种动脉炎病毒科(Ae ter i virus )，动脉炎病毒属的正链RNA病毒。其基因组全长约 15Kb，含有9个开放阅读框。基于系统进化分析，PRRSV被分为基因1型（欧洲型）和基因2型 (北美洲型）。这两种基因型病毒核苷酸序列一致性只有60% 1RRSV在1996年首次在中国出 现，至此之后，该病毒在中国广泛的传播。2006年，高致病性2型PRRSV(Type II Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV)在中 国的猪场出现，其感染数以百万计的猪，致死率高达20%-100%，其临床特征为高热，厌食， 猪身体出现红色斑点以及耳朵发绀，该病的晚期出现腹泻的症状。至此，HP-PRRSV和经典型 2型PRRSV(Type II classical Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，C-PRRSV)在我国共存。HP-PRRSV的危害远比C-PRRSV的危害要大的多，而在临床样品 中快速鉴定HP-PRRSV对于有效控制HP-PRRS起到关键的作用，因此快速、简便、敏感和特异 性的检测HP-PRRSV对于疫病的防控以及流行病学调查至关重要。 Zheng Chai等（A SYBR Green-based real-time RT-PCR assay for simple and rapid detection and differentiation of highly pathogenic and classical type 2porcine reproductive and respiratory syndrome virus circulating in China .Arch Virol (2013) 158:407-415)建立了一种基于 SYBR Green 的实时荧光定量 RT-PCR检测方法，该方法能够同时检测并区别HP-PRRSV和C-PRRSV，而且成本比较低廉，在临床 上得到了较为广泛的应用。但是其缺点在于SYBR Green能够结合所有的扩增产物，并且该 方法通过区分溶解温度来区别HP-PRRSV和C-PRRSV，因此具有很强的非特异性，而且该方法 需要复杂的试验设备以及熟练的操作人员，该方法大约需要一个半小时的试验时间，比较 耗时。 Ha〇-tai Chen等（Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，Journal of Virological Methods 153(2008)266-268)建 立了一种针对PRRSV开放阅读框la设计3对引物来检测HP-PRRSV的RT-LAMP检测方法，该方 法能够更加便捷和快速的对HP-PRRSV进行检测。但是通过RT-LAMP的扩增结果可以看出，该 方法能够出现很多扩增条带，因此同样存在非特异性扩增，而且该方法需要设计三对引物 来进行扩增，因此增加了实验设计的难度，并且增加了其与其他检测平台相结合的难度。此 外，检测温度较高(64°C)，检测时间较长(45min)，并且需要核酸电泳对扩增产物进行检测， 增加了污染的可能性，或者通过与染料结合进行检测，同样具有很强的非特异性。 针对现有技术中存在的问题，本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT‑RPA检测试剂盒，其特征在于包括有一对引物和一条探针，其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：上游引物：5’‑AGCTGATGACACCTTTGAGTGGGTCGGCACCAGTT‑3’下游引物：5’‑CGTCTGTGAGGACGCAGACAAATCCAGAGGCTCAT‑3’探针：5’‑GTCGGCACCAGTTCCTGCACCGCGTAGAAC‑FAM‑dT‑THF‑BHQ1‑dT‑GACAACAACGCTGAC‑P‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨洋，张志东，秦晓东，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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