本发明专利技术公开了一种制备用于修复外周神经损伤的胶原材料的方法。本发明专利技术所提供的方法包括如下步骤：将带有胶原结合区的血管内皮生长因子与有序胶原材料共同孵育，得到所述用于修复外周神经损伤的胶原材料。实验证明，本发明专利技术所提供的含VEGF-CBD因子的外周神经损伤修复胶原材料，可以促进外周神经再生、促进受损的外周神经功能指数恢复、促进外周神经横断部位电生理恢复、促进外周神经受损部位S-100蛋白和/或神经丝蛋白表达、促进外周神经受损部位髓鞘直径和/或髓鞘壁厚度增加、促进靶器官的恢复。可见，该功能材料在未来临床外周神经损伤修复的应用具有更为重要的现实指导意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医用材料领域，涉及一种引导外周神经再生的功能生物材料及其制备 方法。
技术介绍
周围神经损伤（PNI)常常导致患者相关功能的丧失，影响患者的生活质量。由于 产伤、车祸或暴力伤等引起的周围神经损伤会导致感觉或运动神经元的变性坏死。尽管周 围神经有再生的能力，但其功能恢复很不理想。人工神经研究的不断发展，有力地促进了神 经轴突的再生和功能恢复。胶原材料在组织工程中是较好的材料之一。胶原材料因其低免 疫原性和较好的可降解性而被广泛应用于组织再生。 在周围神经系统中生长因子对促进神经生长起重要作用。其中血管内皮生长因子 VEGF是一类富含半胱氨酸的糖蛋白，其中VEGF 165的应用最为广泛，它能促进血管内皮细胞 增殖、分化，抑制内皮细胞细胞凋亡，促进血管平滑肌细胞的迁移等功能，研究证实VEGF促 血管生成作用在外周神经的再生修复中也发挥着重要的作用。但血管内皮生长因子溶液体 内应用后因为其半衰期短、在体液冲刷后大量扩散，因而并不能取得满意的治疗效果。为了 在治疗部位达到有效的药物浓度，周期性注射用药或大剂量给药是常用的方法。但这样的 方法会导致感染或严重的副作用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种制备用于修复外周神经损伤的胶原材料的方法。 本专利技术所提供的用于制备用于修复外周神经损伤的胶原材料的方法，具体可包括 如下步骤：将带有胶原结合区的血管内皮生长因子与有序胶原材料共同孵育，得到所述用 于修复外周神经损伤的胶原材料。 在所述方法中，所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子（VEGF-CBD)和所述有 序胶原材料的配比为：〇. 2nmol :l-10mg。在本专利技术的一个实施例中，所述带有胶原结合区 的血管内皮生长因子（VEGF-CBD)和所述有序胶原材料的配比具体为0. 2nmol :5mg。 在所述方法中，所述孵育可为10-37°c (如25°C )孵育0? 5-1小时（如半小时）。 在所述方法中，所述孵育时的液体环境具体为1 X PBS。 所述IXPBS的pH为7. 4,溶剂为水，溶质及其浓度如下：磷酸二氢钾0. 27g/L，磷 酸氢二钠1. 42g/L，氯化钠8g/L，氯化钾0? 2g/L。 在本专利技术中，所述孵育具体为：将〇.2nmol所述带有胶原结合区的血管内皮生长 因子（VEGF-CBD)溶解于5微升所述IXPBS中，然后滴加到5mg所述有序胶原材料上，25°C 孵育半小时。 在本专利技术中，所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子（VEGF-CBD)的氨基酸序 列具体可为如下（a)或（b): (a)序列表中序列1的第1-184位； (b)序列表中序列1。 其中，序列1由192个氨基酸残基组成。自N末端第1-166位为VEGF的氨基酸序 列；自N末端第178-184位为胶原结合结构域（CBD)的氨基酸序列；自N末端第187-192位 为组氨酸标签。 在本专利技术中，所述有序胶原材料（L0CS)的制备方法，具体可包括如下步骤： 1)将牛筋膜用体积百分浓度为1-1. 5% (如1% )的磷酸三丁酯溶液处理24-72 小时（如48小时）； 2)用含有 0? 5-1. 5mol/L (如 lmol/L)NaCl 的 25-100mmol/L (如 50mmol/L)、pH 为 7. 6-8. 5 (如pH为8. 0)的Tris-HCl缓冲液处理24-72小时（如48小时）； 3)用 1. 25X 105-3. 75X 105U (如（2. 5X105U))胰蛋白酶/100mL 缓冲液处理 48-96 小时（如72小时），得到所述有序胶原材料；所述缓冲液为25-100mm〇l/L(如50mmol/L) Tris-HCl，pH 为 7-8(如 pH 为 8); 上述处理的温度均为2-8°C (如4°C )。 进一步，在步骤3)用胰蛋白酶处理后，还可包括用0? 5-1. 5mol/L强碱溶液（如1M NaOH水溶液）处理5-10分钟（如5分钟）步骤。 步骤1)中所述磷酸三丁酯溶液的溶剂为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液，如 25-100mmol/L (如 50mmol/L)、pH 为 7. 6-8. 5 (如 pH 为 8. 0)的 Tris-HCl 缓冲液。 步骤1)中，所述牛筋膜在处理前还要去除内层粘附的肌肉组织和外层粘附的脂 肪。 利用上述方法制备得到的用于修复外周神经损伤的胶原材料也属于本专利技术的保 护范围。 本专利技术的另一个目的是提供一种用于修复外周神经损伤的胶原支架及其制备方 法。 本专利技术所提供的用于修复外周神经损伤的胶原支架的制备方法，具体可包括如下 步骤： (1)根据待修复外周神经损伤部位的半径，采用胶原膜制备相同半径的胶原管； (2)向步骤（1)制备得到的胶原管中填充所述用于修复外周神经损伤的胶原材 料，即获得了所述用于修复外周神经损伤的胶原支架。 在所述方法中，步骤（1)具体可为：根据待修复外周神经损伤部位的半径，找到 相同半径的模具（材质可为玻璃或塑料），将胶原膜用水（如三蒸水）浸泡（如浸泡1~ 2min)，将浸泡过的胶原膜裹在所述模具上形成管状（如缠绕5/4圈），然用液态胶原涂裹一 圈，风干，10~30°C (如25°C )放置12小时使之交联，去除所述模具，获得所述胶原管。 步骤⑴中，在所述去除模具后，还可包括先后分别采用NaH2P04(0. 1M，溶剂为水） 溶液与水（去离子水）进行洗涤的步骤。具体可为先用NaH2P04(0. 1M，溶剂为水）溶液洗 涤5次，再用水（去离子水）洗涤5次。 步骤（1)中，在去除所述模具后还包括将所述胶原管冻干、辐照（辐射剂量具体可 为8kGy)的步骤。 在所述方法中，步骤（2)中所述填充为将所述胶原管填充至占一半空间。 利用所述方法制备得到的用于修复外周神经损伤的胶原支架也属于本专利技术的保 护范围。 另外，用于修复外周神经损伤的胶原材料，或用于修复外周神经损伤的胶原支架 在如下任一中的应用也属于本专利技术的保护范围： (al)制备促进外周神经再生的材料； (a2)制备促进受损的外周神经功能指数恢复的材料； (a3)制备促进外周神经横断部位电生理恢复的材料； (a4)制备促进外周神经受损部位S-100蛋白和/或神经丝蛋白（NF)表达的材料； (a5)制备促进外周神经受损部位髓鞘直径和/或髓鞘壁厚度增加的材料； (a6)制备促进靶器官恢复的材料。 在（a6)中，所述靶器官为受损伤的所述外周神经直接支配的器官。在本专利技术中， 所述外周神经具体为坐骨神经；所述外周神经损伤具体为坐骨神经横断损伤。更加具体的， 在本专利技术的一个实施例中，所述坐骨神经横断损伤是指将SD大鼠（如成年雄性SD大鼠）的 坐骨神经距梨状肌出口 5_处用减去3_长度的神经后形成的损伤。相应的，所述靶器官具 体为腓肠肌。所述外周神经功能指数具体为坐骨神经功能指数（Sciatic nerve function index, SFI);其计算公式为： SFI = 109. 5(ETS-NTS)/NTS-38. 3(EPL-NP L)/NPL+13. 3(EIT-NIT)/NIT-8. 8 式中，ETS代表右侧足的足趾宽度，EPL代表右侧足的足印长度，EIT代表右侧足的 中间足趾本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备用于修复外周神经损伤的胶原材料的方法，包括如下步骤：将带有胶原结合区的血管内皮生长因子与有序胶原材料共同孵育，得到所述用于修复外周神经损伤的胶原材料。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：戴建武，赵燕南，肖志峰，陈冰，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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