肾脏足细胞的制备方法及其专用培养基技术

本发明专利技术涉及肾脏足细胞的制备方法及其专用培养基。具体地本发明专利技术提供将间充质干细胞诱导为肾脏足细胞的方法，其包括：1)将间充质干细胞接种于培养基1中；以及2)将完成步骤1)的间充质干细胞转接于培养基2中以得到肾脏足细胞，其中所述培养基1由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质包括：1.9％-2.1％的胎牛血清、9.75ng/mL-10.25ng/mL activin A以及0.95×10-5mol/L-1.05×10-5mol/L维甲酸；其中所述培养基2由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质包括：1.9％-2.1％的胎牛血清、9.75ng/mL-10.25ng/mL activin A、0.95×10-7mol/L-1.05×10-7mol/L维甲酸以及19ng/ml-21ng/ml BMP7。本发明专利技术的诱导培养方法，适合于各种脂肪来源的间充质干细胞，该诱导培养方法无病毒导入、易操作、效率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及由间充质干细胞诱导分化细胞的方法，特别涉及肾脏足细胞的制备方法及其专用培养基。
技术介绍
肾脏是人体最重要的器官之一，其主要生理功能是通过生成尿液以清除体内代谢产物、以及进入机体过剩物质和毒物等，同时经重吸收功能保留水份及其他有用物质实现对体液、电解质和酸碱平衡的调节，维持机体内环境的稳定。肾脏足细胞，即肾小囊脏层上皮细胞，是维持肾小球滤过屏障正常结构和功能的重要成分，在维持肾小球通透性，对抗毛细血管腔内流体静水压方面发挥重要作用。高血压、糖尿病、肾毒性药物、原发性肾小球肾炎、肿瘤等多种因素可导致肾脏足细胞的损伤。由于足细胞是高度分化的终末细胞，一旦缺失几乎不可再生，足细胞进行性的损伤丢失，导致肾小球滤过膜的完整性遭到破坏，形成蛋白尿，而蛋白尿的出现又进一步加重足细胞损伤，由此构成的恶性循环最终导致肾小球硬化的发生，影响肾脏功能，引发慢性肾脏疾病(chronickidneydisease,CKD)。临床上针对这些发病机制采取各种可能的治疗方法，包括控制血压、血糖、血脂，药物干预抑制炎症、调节免疫、严格控制蛋白摄入、减少蛋白尿等，尽可能的延缓肾脏疾病的进展。但是由于治疗反应性不一，部分病人病情持续进展，肾功能的进行性下降，最终导致终末期肾病(endstagerenaldisease,ESRD)。据美国肾病数据登记系统(theUnitedStatesRenalDataSystem，USRDS)显示，CKD在成人中的发生率大约为13.6％，且近年来CKD的发病率在不断增加，截止2012年，美国国内ESRD患者达636905例，新增患者114813例，其中88638人死于ESRD。血液透析、腹膜透析和肾脏移植仍是目前CKD及ESKD最主要和最有效的治疗手段，然而透析只能部分代替肾脏的滤过功能，肾脏移植仍是目前ESRD患者恢复健康最为理想的治疗方法。但是移植器官资源严重匮乏，远远不能满足病人的需求，绝大部分ESRD患者由于未能及时接受肾脏移植而死于慢性肾脏疾病及其相关并发症，慢性肾脏疾病已成严重威胁人类健康的疾病之一。干细胞(stemcell)是一类高度增殖，具有自我更新和多向分化潜能的细胞，在一定条件下，干细胞可以分化成多种功能细胞。依据干细胞来源可将其分为：胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)、成体干细胞和诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSs)。间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是一类具有免疫调节功能和高度可塑性的成体干细胞，其来源广泛，取材方便，且具有低免疫原性，不受伦理限制及没有成瘤危险的特点，因此以MSCs为种子细胞，通过体外诱导定向分化为肾脏足细胞，修复肾小球滤过屏障，改善肾脏功能的作用，具有较高的临床应用价值。在适当的体外培养条件下，间充质干细胞可诱导分化为神经细胞、心肌细胞、胰岛分泌细胞、肝细胞等多种成熟细胞，用以修复替换功能损伤的组织和器官，有效的改善相应损伤组织的功能。近年来研究结果也表明，多种来源的干细胞具有向肾脏组织细胞分化的潜能，可以替代受损的肾脏细胞。成熟肾脏中包含至少26种细胞，现有诱导体系，在体外诱导干细胞向肾脏细胞分化的效率以及分化细胞的种类都非常有限，大部分研究报道均集中在肾小管细胞的诱导分化，对于肾脏足细胞的分化研究还处于初步探索中，而针对间充质干细胞体外向肾脏足细胞诱导培养体系的尚无报道。仅有相关文献利用诱导多能干细胞(ips)诱导获得肾脏足细胞，由于iPSCs是由多种成体细胞重编程诱导获得，来源广泛，避免了胚胎干细胞面临的伦理学问题和免疫排斥的问题。但是由于目前iPSCs转化效率低，重编程机制的不明确以及在重编程过程中可能引发致癌基因的活化，也限制了iPSCs细胞在临床治疗中的进一步应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肾脏足细胞的制备方法及其专用培养基。一方面，本专利技术提供将间充质干细胞诱导为肾脏足细胞的方法，其包括：1)将间充质干细胞接种于培养基1中；以及2)将完成步骤1)的间充质干细胞转接于培养基2中以得到肾脏足细胞，其中所述培养基1由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质包括：1.9％-2.1％的胎牛血清、9.75ng/mL-10.25ng/mLactivinA以及0.95×10-5mol/L-1.05×10-5mol/L维甲酸；其中所述培养基2由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质包括：1.9％-2.1％的胎牛血清、9.75ng/mL-10.25ng/mLactivinA、0.95×10-7mol/L-1.05×10-7mol/L维甲酸以及19ng/ml-21ng/mlBMP7。优选地，本专利技术的方法包括如下步骤：1)将间充质干细胞接种于所述培养基1中，培养2-4天；以及2)将完成步骤1)的间充质干细胞转接于所述培养基2中，培养5-7天得到肾脏足细胞。优选地，在所述步骤1)中培养3天，以及在所述步骤2)中培养6天。优选地，本专利技术的方法中所述动物细胞基础培养基是DMEM/F12培养基，在培养基1中溶质包括2％的胎牛血清、10ng/mL的activinA和10-5mol/L的维甲酸；以及在培养基2中包括2％的胎牛血清、10ng/mL的activinA、10-7mol/L的维甲酸和20ng/ml的BMP7。优选地，在本专利技术的所述步骤1)中，所述间充质干细胞在所述培养基1中的初始浓度可为3×105个/ml-6×105个/ml，优选为5×105个/ml；优选地，培养过程的培养条件可为：在37℃、5％CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中培养。优选地，其中所述步骤1)为在6孔板中加入培养基1，每孔2ml，然后接种第3代间充质干细胞，使其在培养基中的浓度为5×105个/ml，在37℃、5％CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中培养3天，每1.5天吸弃上清并加入2ml新的培养基1；以及所述步骤2)为吸弃步骤1的6孔板中的上清，加入培养基2，每孔2ml，在37℃、5％CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中培养6天，每2天吸弃上清并加入2ml新的培养基。优选地，本专利技术的方法特征在于所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞；优选地，所述脂肪间充质干细胞为人间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞为第三代间充质干细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将间充质干细胞诱导为肾脏足细胞的方法，其包括：1)将间充质干细胞接种于培养基1中；以及2)将完成步骤1)的间充质干细胞转接于培养基2中以得到肾脏足细胞，其中所述培养基1由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质包括：1.9％‑2.1％的胎牛血清、9.75ng/mL‑10.25ng/mL activin A以及0.95×10‑5mol/L‑1.05×10‑5mol/L维甲酸；其中所述培养基2由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质包括：1.9％‑2.1％的胎牛血清、9.75ng/mL‑10.25ng/mL activin A、0.95×10‑7mol/L‑1.05×10‑7mol/L维甲酸以及19ng/ml‑21ng/ml BMP7。

【技术特征摘要】
1.一种将间充质干细胞诱导为肾脏足细胞的方法，其包括：
1)将间充质干细胞接种于培养基1中；以及
2)将完成步骤1)的间充质干细胞转接于培养基2中以得到肾脏
足细胞，
其中所述培养基1由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质
包括：1.9％-2.1％的胎牛血清、9.75ng/mL-10.25ng/mLactivinA以及
0.95×10-5mol/L-1.05×10-5mol/L维甲酸；
其中所述培养基2由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质
包括：1.9％-2.1％的胎牛血清、9.75ng/mL-10.25ng/mLactivinA、
0.95×10-7mol/L-1.05×10-7mol/L维甲酸以及19ng/ml-21ng/mlBMP7。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述步骤1)中培
养2-4天，以及在所述步骤2)中培养5-7天，优选在所述步骤1)中
培养3天，以及在所述步骤2)中培养6天。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述动物细胞基础培养
基是DMEM/F12培养基，
在培养基1中包括2％的胎牛血清、10ng/mL的activinA和
10-5mol/L的维甲酸；以及
在培养基2中包括2％的胎牛血清、10ng/mL的activinA、10-7mol/L
的维甲酸和20ng/ml的BMP7。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其中在步骤1)中所述间充质干
细胞的浓度为3×105个/ml-6×105个/ml，优选为5×105个/ml。
5.根据权利要求1-4所述的方法，其特征在于所述间充质干细胞
为脂肪间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞为人间充质干细胞；
优选地，所述间充质干细胞为第三代间充质干细胞；优选地，所述间...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵春华，张丽娜，李康华，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11