本发明专利技术公开了一种切克酶介导等温扩增小分子信标定量检测技术。本发明专利技术综合了切克酶介导等温扩增技术和分子信标定量技术，主要包括样品基因组的提取，实时荧光PCR反应和信号检测。本发明专利技术在切克酶介导等温扩增过程中加入设计好的小分子信标，随着模板DNA/RNA的扩增，小分子信标不断退火结合到模板上释放荧光信号，释放的荧光信号累积形成模板扩增曲线。依据标准浓度模板的扩增曲线绘制标准曲线，从而确定待测模板是否为目的产物及其含量。本发明专利技术将小分子信标应用到等温扩增中，达到准确定量目的，简化了操作步骤，提高效率，且实现了待检样品的实时检测，增加结果特异性和灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体设及一种等温扩增小分子信标定量检测技术，属 于分子生物学等温检测领域。
技术介绍
[000引PCR自专利技术W来，因为具有灵敏性高、特异性强、快速便捷和经济实用的特点，迅速 在临床诊断、分子克隆等方便得到了广泛发展和应用。因此，越来越多的研究者考虑使用该 项技术。然而，PCR技术也逐渐暴露出了其反复热变性的高要求性、耗时性，W及由于灵敏 度高，容易产生假阳性反应的缺陷；并且，由于检测形式单一，结果不易判读等缺点，越来越 多的研究人员专注于等温扩增技术的开发和研究。等温扩增技术由于其有灵敏、特异、反应 迅速等优点，逐渐显示出其广泛应用的潜力。 根据DNA在烙解状态的特殊存在状态，人们开始尝试创新发展无须热变性的核酸 恒温扩增技术，挖掘其在各领域应用的潜力。该些核酸等温扩增的新技术不仅大大简化了 实验过程，而且能够使扩增技术在恒温状态下进行，极大的满足了研究者，尤其是现场检测 工作者的需求。到目前为止，已陆续开发出了如环介导等温扩增技术（LAMP)、链置换扩增技 术（SDA)、切克内切酶介导恒温扩增（NEMA)、依赖解旋酶核酸扩增技术（HDA)、滚环扩增技 术（RCA)、重组酶介导等温扩增技术（RAA)等多种恒温扩增新方法。该些方法大致可归为两 类，一类是依赖链置换原理的扩增技术，主要包括LAMP、SDA、NEMA等。其主要原理为依靠具 有链置换活性的DNA聚合酶（如BstDNA聚合酶），采用两对引物同时扩增，外引物可将内 引物的延伸产物剥离从而达到循环扩增的目的。另一类是依赖单链模板复制原理的扩增技 术，主要包括HDA、RCA、RAA等。其主要原理为模拟遗传物质的增殖达到扩增目的。目前原 料较易获得且扩增稳定的是第一类方法。 LAMP是目前应用最广泛的等温扩增技术，但是LAMP引物设计复杂，扩增反应易污 染；NEMA由于其固有的优势受到极大关注。NEMA是利用内切酶活性和DNA聚合酶实现的扩 增反应，它仅仅需要两对引物和两种特殊功能的酶，分别是限制性内切酶和具有链置换活 性的DNA聚合酶。弓I物与DNA单链结合后产生的内切酶识别位点经内切酶作用后依赖DNA 聚合酶在切割处延伸3'端，并替代另一条DNA链；替代的链与引物杂交后又可作为另一个 新的扩增反应的模板。该技术使用的切克内切酶具有其特殊性，该种酶特异性地识别酶切 位点并只切割其中一条链，从而实现扩增的目的。 对于扩增技术来说，一种合适的技术不仅能做到定性判断目的基因是否扩增，还 应该达到表征目的基因含量及拷贝数的目的，该种思想催生了定量扩增技术的发展。定 量的方法主要是借助光学现象，即SYBRGreenI，化qman巧光探针和分子信标法。SYBR GreenI可W与双链的DNA分子产生特异性的结合，巧光信号随着PCR反应的进行逐渐增 大。化qman探针可W与目的片段特异性结合，探针5'端的巧光报告基团和3'端标记的巧 光泽灭基团会被Taq扩增酶的外切活性切开从而产生巧光信号。对于链置换为基础的等温 扩增技术而言，SYBRGreenI的非特异性和化qman的外切酶需求都难W满足定量需求。 分子信标是一种茎环状结构的核酸探针，在长度为15-30bp寡核巧酸探针两端分 别加上5-8bp的茎杆区，环状部分与模板互补，根茎两端的核酸序列互补配对，因此标记在 一端的巧光基团与标记在另一端的泽灭基团紧紧靠近，巧光几乎被完全被巧灭。当环状部 分与模板结合后，茎环结构打开，巧光基团与泽灭基团原理发出巧光。所检测到的巧光强 度与模板的量成正比。分子信标技术W其操作简单、灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实 时定量测定，甚至可用于活体分析等特点不仅在分子生物学检测中充当重要角色，在基因 检测与诊断等医学领域也有广泛应用。目前，已有的专利技术专利中均是关于分子信标检测 技术的报道，且主要应用LAMP对小分子短链核酸进行检测（详见专利201310068455. 2， 201410123428. 5, 201410191895. 1，201310597782. 7, 201310659524. 7)，难W实现常规的扩 增检测效果。本专利技术专利首次在已经建立的小分子信标检测基础上将其引入等温扩增技 术，实现检测效果，并建立标准曲线达到定量目的，实现等温扩增的快速定量检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种切克内切酶等温扩增与小分子信标定量结合的检测 方法，将实时巧光PCR原理与等温扩增相结合，W达到对等温扩增产物定量的目的。[000引本专利技术主要包括小分子信标设计，样品核酸提取，实时等温扩增和信号检测，确定 样品是否为目的产物。 第一步，小分子信标设计。 分子信标包括茎杆区和环状区；环状区能与DNA/RNA模板特异互补结合，茎杆区 位于环状区两侧，分别为5 '茎杆区和3'茎杆区。5 '茎杆区和3'茎杆区序列互补，使其形 成发夹结构；分子信标5 '和3'端修饰有巧光基团，环状区核酸链长度为10-20个碱基，茎 杆区核酸链长度为5-6个碱基。 茎杆区标记巧光基团，其中5'标记的巧光分子为FAM、VIC、肥X、TET、切3、切5、 ROX、JOE等有机巧光染料或量子点等无机染料中的任一种；3 '标记的巧光分子为TAMRA、 DABCYL、MGB、B册-1、B册-2等有机巧光染料的任一种。 分子信标退火温度与引物的退火温度和反应温度相近，都在58-60°C。 第二步，样品核酸提取。 使用植物基因组DNA提取试剂盒（天根）或血液/细胞/组织基因组DNA提取试 剂盒（天根）或RNA提取试剂盒（天根），溶于50 y L缓冲液中，保存于-20°C冰箱。 第S步，小分子信标实时等温扩增， 将A部分配置完毕后进行95°C变性处理5min，之后冷却至室温，加入预先混合好 的B部分配置成25yL反应体系。 将25 uL反应体系放入Bio-Rad CRX96实时巧光定量PCR仪中，设定反应程序； 反应温度58-60°C，扩增时间比，每30s采集一次巧光信号；或者是58-60°C，扩增循环数为 120,每一个循环义集一次巧光信号。[001引 25uL反应体系如下；其中，lOXThermol化1 buffer的组成为；200mMTris-肥l、100mM(NH4)2S〇4、 100mMKCl、20mMM拆〇4、l%T'm〇n坂X-100、抑8. 8(25°C)。 第四步，信号检测。 小分子信标在反应初期经历茎环闭合过程，在指数或超指数扩增期逐渐打开并起 到监测效果，故W最低巧光值的绝对值设定基线。通过基线读取Ct值，根据信号采集获得 的曲线绘制标准曲线，标准曲线采用模板浓度的对数与指数型扩增开始时的反应时间或Ct 值作图，R2〉0. 9 ;根据样品的反应时间或Ct值判断样品含量。 本专利技术综合链置换等温扩增和小分子信标定量技术，使DNA在等温条件下扩增， 随着扩增过程的进行巧光信号逐渐释放。在没有目的模板的情况下，小分子信标处于闭合 状态，从而提高了定量检测的特异性；同时本专利技术打破W往常规分子信标设计原则，由于等 温扩增温度从开始的室温上升至反应温度后保持不变，将小分子信标的退火温度设定至反 应温度附近，该样有助于信标在反应温度下与互补区域退火结合。此后小分子信本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种切克酶介导等温扩增小分子信标定量检测技术，主要包括以下步骤：(1)小分子信标设计：小分子信标包括茎杆区和环状区；环状区能与DNA/RNA模板特异互补结合，茎杆区位于环状区两侧，分别为5‘茎杆区和3’茎杆区。5‘茎杆区和3’茎杆区序列互补，使其形成发夹结构；小分子信标5‘和3’端修饰有荧光基团；(2)样品核酸提取：提取待测样品的核酸(DNA或RNA)；(3)切克酶介导等温实时定量反应：反应体系分为A与B两部分，A部分进行95℃变性处理，冷却至室温，之后加入B部分，进行实时荧光PCR反应，等温扩增目的基因；(4)对扩增结果进行荧光信号收集及信息分析，确定产物是否为目的产物及其含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，黄昆仑，王晨光，翟百强，罗云波，朱鹏宇，徐瑗聪，
申请(专利权)人：北京福德安科技有限公司，中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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