本发明专利技术公开了一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基及方法，该专用培养基成分包括bFGF、activin A、Y27632、Knockout SR和β-巯基乙醇 。培养方法是将干细胞培养器皿预先用细胞外基质包被；然后将猪囊胚用蛋白酶消化去除透明带，转入干细胞培养器皿中，添加本发明专利技术的专用培养基；培养至形成总细胞数为1000~2000个的滋养层干细胞克隆团时，消化成单细胞，转入新的经细胞外基质包被的培养器皿进行细胞的传代培养。本发明专利技术的专用培养基成分确定，使用安全性高，避免异源细胞的污染。培养方法简单高效，对猪滋养层干细胞培养具有克隆形成率高、细胞凋亡率低、增殖传代能力强和安全稳定的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞技术研宄领域，具体涉及一种培养猪滋养层干细胞的专用培养 基及方法。
技术介绍
干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺 乳类动物的各组织器官的原始细胞。医学界称其为"万用细胞"。 动物胚胎早期发育至囊胚时出现第一次细胞分化，形成两种特征和功能各异的内 细胞团和滋养层。滋养层干细胞是胎盘组织细胞的祖细胞，逐步分化为滋养层前体细胞、 绒毛膜滋养层、合胞体滋养层和多核巨细胞等。胚胎发育早期的表观重编程过程中DNMTs、 TETs、HDACs等相关酶共同作用维持滋养层细胞基因组整体低甲基化水平和绒毛膜滋养 层的染色质凝聚，参与调节滋养层的分化、迀移和侵入子宫内膜的能力（Logan et al.， 2013)。为了揭示滋养层分化发育中如此复杂的分子机制，从早期胚胎分离纯化滋养层干细 胞，建立其体外培养的模型是很有必要的。最早从小鼠囊胚滋养外胚层成功分离得到滋养 层干细胞，它们在添加碱性成纤维细胞生长因子bFGF和人白血病抑制因子hLIF的环境下 能维持自我更新，注射入小鼠囊胚后能嵌合入小鼠胎盘的各个部位，而并不存在于小鼠胎 儿的各胚层中（Tanaka et al·，1998; Takahashi and Yamanaka.，2006; Rielland et al.，2008)。其他一些动物的滋养层细胞系也已经建立，包括牛、羊和猪等，这些细胞能进 行连续传代培养，表现上皮细胞的特征。然而，有蹄类大动物的滋养层干细胞的细胞增殖和 更新相关的关键信号通路与小鼠存在诸多未知差异，这一经典的小鼠滋养层干细胞的培养 体系并不适用于家畜和灵长类等大动物的滋养层干细胞的分离培养。不同种类动物的干细 胞分离培养所需的生长因子和调控通路存在较大的差异，目前国内外尚无猪的早期囊胚来 源的滋养层干细胞成功建系和干细胞特性鉴定的报道。人和恒河猴等灵长类动物由于早期 胚胎获取困难的因素，在摸索适宜的滋养层干细胞培养体系研宄上将花费更长的时间。这 与至今仍无真正意义上的家畜和灵长类的胚胎干细胞成功建系的情况相似。 滋养层干细胞已经在小鼠着床前期和着床后的胚胎中都能分离获得，然而，国内 外尚无报道在猪、牛和羊等有蹄类动物中也能获得类似于小鼠中的这种能够增殖更新、具 有多能性的滋养层干细胞。猪胎盘来源的滋养层细胞系已经建立，这些细胞能进行连续 传代培养，表现上皮细胞的特征，表达分化标记核纤层蛋白A/C，但没有多能干细胞特征 (Flechon et al·，1995; La Bonnardiere et al·，2002)。宋志强等（2013)运用小鼠胎 儿成纤维细胞作为饲养层细胞，在基础培养液中添加成纤维细胞生长因子FGF4和人白血 病抑制因子LIF，从第6天的孤雌囊胚中分离到猪滋养层干细胞样细胞。其试验中培养效率 低，约为30个囊胚能获得1个细胞克隆团，在形态上体现了滋养层干细胞特征，但未能证明 其干细胞特性，也就是说还没有获得真正的猪滋养层干细胞。李荣凤等（2013)专利技术了一种 牛滋养层干细胞建系方法，是将牛囊胚接种于小鼠胎儿成纤维细胞和fct-3A小鼠皮下结 缔组织细胞的饲养层中，在培养液中加入小分子抑制剂Η)0325901和CHIR99021进行细胞 的传代培养。该培养体系是经典的胚胎干细胞培养方法，由此获得的滋养层干细胞是由胚 胎干细胞在特定条件下衍生转化而来的一类细胞，与滋养外胚层来源的干细胞可能存在一 些本质和潜在特征的区别。
技术实现思路
为了克服现有技术中的上述问题，本专利技术提供了一种培养猪滋养层干细胞的专用 培养基。 本专利技术提供的培养猪滋养层干细胞的专用培养基，成分包括bFGF、activin A、 Y27632、Knockout SR和β-巯基乙醇。以上成分均已经商品化，可以直接购买市售商品， 例如其中bFGF、activin A、Knockout SR和β-疏基乙醇可购自Gibco品牌，Υ27632可购 自Sigma品牌。 bFGF :碱性成纤维细胞生长因子，是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白，在胚胎发育 和分化的多个生物学反应过程中激活FGF信号通路，是一种在细胞培养中应用广泛的生物 活性蛋白。 activin A :激活素 A，是细胞因子TGF β超家族的成员，TGF β超家族介导的信 号通路在维持胚胎干细胞自我更新和特异的分化过程中发生了不同的生物学效应，具体细 胞的命运主要依赖细胞接受信号的阶段，以及细胞因子的水平和与其他细胞因子的相互作 用。bFGF和activin A单独长期作用都会诱导干细胞分化，而它们共同作用时却能够维持 干细胞的多能性，暗示了它们之间存在着相互调控的机制。 Y27632 :化学式C14H21N3O,是一种Rho蛋白激酶（ROCK)特异性抑制剂，结构式如 下：已有研宄表明Y27632能够引起人胚胎干细胞形态发生改变，由质地紧密的细胞集落 变得松散扁平，将Y27632应用于人胚胎干细胞传代，能够显著提高传代效率。在胚胎干细 胞特性维持方面，ROCK抑制剂的作用特点还没有定论，但是在本专利技术中，通过对猪滋养层干 细胞进行形态学观察评定和干细胞标记基因表达水平检测，证明Y27632不会对干细胞的 多能性维持产生不利影响，而能抑制细胞传代过程中出现的凋亡效应，说明它可以安全地 用于猪滋养层干细胞的培养。 Knockout SR :Knockout血清替代物，是成分确定的无血清制剂，用于替代胎牛血 清，促进未分化多能干细胞生长。传统的胚胎干细胞培养基配方大多需要胎牛血清，血清中 含有许多未知的成分和一些诱导细胞分化的因子，且会造成异种血清蛋白的污染问题。因 此为了解决这个问题，科学家们提出了无血清培养体系，研发出Knockout SR可以有效维持 胚胎干细胞未分化的状态，维持干细胞增殖。 β -巯基乙醇：β -巯基乙醇能诱导细胞增殖，促进DNA合成，同时能避免过氧化物 对体外培养细胞的损害，阻碍多能性干细胞的分化趋势。常用于培养胚胎干细胞、诱导多功 能干细胞和神经干细胞等。 实验发现bFGF、activin A、Y27632、Knockout SR和β-巯基乙醇的组合能有效维 持猪滋养层干细胞的迅速增殖和更新。其中在培养体系中撤掉bFGF、activin A或Knockout SR导致细胞增殖速度显著降低，不添加 Y27632则导致细胞在传代后大部分出现凋亡现象， 只有约30%的细胞能继续生长。而不添加 β-巯基乙醇后干细胞克隆边缘变松散，细胞趋 向分化状态。 优选地，上述培养猪滋养层干细胞的专用培养基中，bFGF的浓度为12. 5~50ng/ ml,, activin A 的浓度为 5~20ng/mL，Y27632 的浓度为 2~1 Onmol /mT,, Knockout SR 的体积 浓度为2%~5%，β-巯基乙醇的浓度为20~55 nmol/mL。该范围浓度的bFGF、activin A、 Y27632、Knockout SR和β -巯基乙醇，能够更加有效地维持干细胞的多能性和增殖更新。 优选地，上述培养猪滋养层干细胞的专用培养基中，还包括DMEM/F12培养基、 Neurobasal 培养基、Ν-2 supplement本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基，其特征在于，成分包括bFGF、activin A、Y27632、Knockout SR和β‑巯基乙醇。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴珍芳，贺晓燕，孟繁明，李紫聪，石俊松，周荣，张献伟，
申请(专利权)人：广东温氏食品集团股份有限公司，华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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