本发明专利技术公开了属于生物工程技术领域的一种产γ-氨基丁酸的工程菌及其构建和应用，所述工程菌是通过将编码L-谷氨酸脱羧酶的基因及其启动子整合到宿主菌的染色体上得到的，整合的位点为γ-氨基丁酸转氨酶基因中。本发明专利技术构建的工程菌遗传稳定性好，表达的L-谷氨酸脱羧酶活性高，没有多余蛋白尤其是抗生素抗性蛋白表达，安全性高，同时工程菌中失活了降解产物γ-氨基丁酸的γ-氨基丁酸转氨酶，避免了生产过程中产物的分解，提高了产品的收率。本发明专利技术的工程菌以L-谷氨酸为原料，生物转化法高效生产γ-氨基丁酸，所生产的γ-氨基丁酸没有内毒素污染的威胁，安全可靠，可用于食品保健品领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种产Y-氨基丁酸的工程菌及其构建和应用，属生物工程技术领 域。
技术介绍
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA)是广泛分布于动物体内的一种重要 的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，在大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑起重 要作用，并对机体的多种功能具有调节作用，包括参与产生镇静、镇痛效应、抗焦虑、防治惊 厥、舒缓血管和降血压、防止动脉硬化调节心律失常以及调节生殖生理激素的分泌的功能。 正是由于具有的多种生理功能，γ-氨基丁酸在医药、保健品、食品、饲料添加剂等领域具有 广泛的应用。2009年，卫生部更是批准 γ-氨基丁酸为新资源食品。 γ -氨基丁酸的生产主要是通过L-谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸形成。目前常用 的生产γ -氨基丁酸的菌是大肠杆菌和乳酸菌，其中大肠杆菌遗传操作成熟，发酵密度高， 表达量高，因此用于生产γ-氨基丁酸的工艺产量高，生产成本低。但大肠杆菌在发酵过程 中会产生内毒素，在生产过程中会带入到最终产品中，因此用大肠杆菌生产的γ-氨基丁 酸在食品和保健品中的应用受到很大限制。乳酸菌是安全级别的细菌，早已应用于乳制品 等食品工业中，因此用乳酸菌生产的γ-氨基丁酸安全级别高，在食品和保健品领域中应 用很受欢迎。但乳酸菌发酵的生物量少，产生的L-谷氨酸脱羧酶活性低，最终产生的γ-氨 基丁酸浓度低，生产成本很高，导致其最终产品的市场售价居高不下，不利于其进一步的推 广应用。 枯草芽孢杆菌是一种食品安全的微生物，在食品领域的应用已持续了几千年，其 安全性早已被大家所公认。但野生型的枯草杆菌自身的L-谷氨酸脱羧酶表达量很低，发 酵产生的酶不足以用于工业化生产，因此需要将L-谷氨酸脱羧酶基因在枯草杆菌中进行 外源表达。中国专利文献CN103409457A公开了一种新型枯草杆菌表达系统，并且公开了利 用所述新型的枯草杆菌表达系统构建重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌，并将此工程菌用于 γ -氨基丁酸的生产。所述的新型枯草杆菌表达系统，包括基因工程菌株BS-T710与表达载 体pBT-23a。表达载体pBT-23a是将Τ7启动子基因插入枯草杆菌表达载体ρΗΤ43的KpnI/ XbaI酶切位点间所得。基因工程菌株BS-T710通过如下方法构建：将Pgrac基因，T7RNA 聚合酶基因 T7plo,及枯草杆菌色氨酸终止子Ter融合，构成T7pol的完整表达元件，并将 T7pol的完整表达元件插入到枯草杆菌整合载体pDG1730的EcoRI酶切位点，得到T7RNA 聚合酶整合表达载体pDG1730-T7pol ;将T7RNA聚合酶整合表达载体pDG1730-T7pol转化 入枯草杆菌168菌株得到基因工程菌株BS-T710。产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌是将 来源于Streptococcus thermophilus Y2的谷氨酸脱羧酶基因 gadB插入至上述表达载体 pBT_23a，获得重组表达载体pBT-23a_gad，利用化学转化法，将pBT-23a_gad转化入上述基 因工程菌株BS-T710,获得产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌BS-T710-gadB。上述枯草杆 菌表基因工程菌是为了克服枯草芽孢杆菌表达系统缺乏高效转录外源基因的启动子的缺 陷，提供一种具有高效转录谷氨酸脱羧酶基因的启动子的基因工程菌。 而上述基因工程菌利用质粒表达载体表达外源基因，存在两个缺陷，一是质粒在 枯草芽孢杆菌中复制尤其是在大规模发酵时，传代不稳定，会导致发酵后期蛋白表达的减 少；二是枯草芽孢杆菌的表达质粒为了筛选方便，都存在编码抗生素抗性酶的基因，这导致 在发酵过程中细菌会额外表达无用的酶，尤其是抗生素抗性酶，在安全要求很严格的食品 工业中，其应用受到限制。
技术实现思路
为此，本专利技术针对于现有技术中枯草芽孢杆菌表达系统利用质粒表达外源基因传 代不稳定导致后期蛋白表达减少、存在抗生素、抗性酶的基因导致资源浪费和安全性低的 缺陷提供一种不利用质粒表达外源基因、遗传稳定、安全性高、高效表达表达L-谷氨酸脱 羧酶的产γ-氨基丁酸的工程菌及其构建方法。 进一步的，本专利技术针对于现有技术中枯草芽孢杆菌野生型自身的L-谷氨酸脱羧 酶表达量很低，提供一种产γ -氨基丁酸的工程菌及其构建方法，其通过引入grac启动子， 将L-谷氨酸脱羧酶编码基因的表达元件整合到枯草芽孢杆菌的染色体上，并通过上述整 合同时敲除γ-氨基丁酸转氨酶基因来提高L-谷氨酸脱羧酶表达量和减少γ-氨基丁酸 代谢，使γ-氨基丁酸的产量提高。 为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下： -种产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其通过将编码L-谷氨酸脱羧酶的 基因（gadB)及其启动子整合到宿主菌的染色体上得到的。 所述的产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，整合的位点为γ-氨基丁 酸转氨酶基因（gabT)中，整合后使γ-氨基丁酸转氨酶基因失活。 所述的产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，将所述编码L-谷氨酸脱 羧酶的基因整合到宿主菌的染色体是通过PMAD整合载体实现的。 所述的产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，所述启动子为grac启动 子，来源于ΡΗΤΟΙ表达载体。 所述的产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，所述宿主菌为枯草芽孢 杆菌，优选为枯草芽孢杆菌168菌株。 所述的产Y-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，所述编码L-谷氨酸脱羧 酶的基因来源于微生物，可为大肠杆菌或其他能表达相同功能酶的微生物。 L-谷氨酸脱羧酶基因的获得可根据GenBank No:M84025. 1中gadB基因序列全基 因合成，或利用大肠杆菌（如菌株DH5a)的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得。 本专利技术还提供了利用上述产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法构建的基因 工程菌以及所述基因工程菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。 -个实施例中，所述基因工程菌的构建方法可以是将L-谷氨酸脱羧酶基因先克 隆到大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭表达载体PHTOl (德国MoBiTec公司）上，然后将包含 了启动子和L-谷氨酸脱羧酶编码基因在内的DNA片段和枯草芽孢杆菌待整合位点上下游 各1000 bp左右的同源臂片段通过overlap-PCR融合成一个长片段，再将该片段克隆到质粒 pMD上得到整合用的载体，最后将该载体转化枯草芽孢杆菌，并通过实验操作和验证，完成 L-谷氨酸脱羧酶编码基因的表达元件整合到枯草芽孢杆菌的染色体上，实现在枯草芽孢杆 菌中的高效稳定表达。 所述穿梭表达载体pHTOl，系德国MoBiTec公司产品，大小为8kb，大肠杆菌和枯草 芽孢杆菌双复制起始位点的穿梭表达载体，含有氨苄青霉素抗性基因（大肠杆菌中）和氯 霉素抗性基因（芽孢杆菌中），乳糖抑制子IacI基因，启动子是grac，需要IPTG诱导外源 基因表达，并具有多个限制性内切酶位点。 所述的基因工程菌在生产Y-氨基丁酸中的应用，其中，所述基因工程菌作为生 产γ-氨基丁酸的酶源。 所述的基因工程菌在生产γ-氨基丁酸中的应用，其中，生产γ-氨基丁酸的方法 为： 1)活化培养工程菌种子，并将培养好的种子逐级放大，并在发酵罐中进行好气培 养，培养温度3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产γ‑氨基丁酸的工程菌的构建方法，其特征在于，其通过将编码L‑谷氨酸脱羧酶的基因及其启动子整合到宿主菌的染色体上得到的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：史吉平，柳鹏福，
申请(专利权)人：南京本贝德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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