使用小分子从多能干细胞产生胰内胚层制造技术

产生表达至少5%PDX1/NKX6.1双阳性的胰细胞或胰细胞前体的方法，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的一种或多种小分子，以使人定形内胚层细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。本发明专利技术还涉及通过所述方法产生的胰内胚层细胞和所述胰内胚层细胞的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从多能干（PS)细胞例如人定形内胚层产生胰内胚层的方法。 专利技术背景 0细胞移植潜在地提供了I型糖尿病的最终治疗。然而，供体0细胞有限的可用性制 约了该治疗作为临床治疗的用途。多能干细胞可无限增殖和分化为多种细胞类型；因此，PS 细胞为有希望的0细胞来源。然而，在PS细胞可用于治疗糖尿病前，其需要有效和可再生 地分化为胰细胞。 在脊椎动物胚胎发育期间，多能细胞产生三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层。对 于形成内胚层衍生组织，定形内胚层（DE)的诱导是第一步；从DE细胞产生胰内胚层（PE) 为产生产胰岛素的0细胞所必需的。具有成为内分泌祖细胞（EP)潜能的PE细胞特征在 于两个重要转录因子H)X1和NKX6. 1的共表达。 对于从PS细胞产生胰细胞已经建立了分步体外分化方案。这些方案一般模拟胰 发育的主要事件，其包括几个阶段例如共表达SOX17和FOXA2的DE、原肠、后前肠、PE、EP 和最后成熟0细胞的形成。迄今为止，hES细胞的有效DE分化已通过激活蛋白A处理实 现。产生胰0细胞的下一个主要步骤为产生共表达H)X1和NKX6. 1的PE。已开发出几组 可将PS细胞分化为DE和PE的体外方案，然而其仅能产生中等分数的NKX6. 1/H)X1双阳性 (db+ve)细胞，而且重要的是其中无一能够体外产生完全成熟的0细胞（Cai等（2010); D'Amour等（2006);Kunisada等（2012);Schulz等（2012);Zhang等（2009);Ameri等 (2010))〇 概述 本专利技术涉及产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达roxi和NKX6.1，包括将定形内胚层（DE)细胞暴露于有效量的由以下组成的组中的至少一种化合 物： a.BMP抑制剂LDN-193189 (在表1中列出） b?激酶抑制剂（在表1和表2中列出） c.视黄酸受体激动剂（在表2中列出）， 以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。 本专利技术进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共 表达roxi和NKX6. 1，包括将DE细胞暴露于有效量的由以下组成的组中的至少一种化合 物： a. BMP抑制剂LDN-193189 (在表1中列出） b. 具有或不具有N-烷基化的1，9-吡唑并蒽酮的异构体（在表1和2中列出） c. 视黄酸受体激动剂（在表2中列出）， 以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体（pancreaticorpancreaticcell precursors)〇 本专利技术进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共 表达roxi和NKX6. 1，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的由以下组成的组中的至少一 种化合物： a. BMP抑制剂LDN-193189 b. JNK抑制剂II c.AM580， 以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。 本专利技术进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共 表达H)X1和NKX6. 1，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的BMP抑制剂LDN-193189,以使 人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。 本专利技术进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共 表达H)X1和NKX6. 1，包括将DE细胞暴露于有效量的BMP抑制剂LDN-193189,并随后暴露 于下列分子之一， a. Wnt抑制剂IWP2 b. Hedgehog抑制剂环巴胺（Cyclopamine,Cyc) 以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。 本专利技术进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共 表达roxi和NKX6. 1，包括将DE细胞暴露于有效量的BMP抑制剂LDN-193189,并随后暴露 于JNK抑制剂II、视黄酸或视黄酸衍生物、bFGF和下列分子之一的组合： a. Wnt抑制剂IWP2 b.Hedgehog抑制剂环巴胺 以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。 本专利技术进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共 表达roxi和NKX6. 1，包括将DE细胞暴露于有效量的BMP抑制剂LDN-193189,并随后暴露 于JNK抑制剂II与视黄酸或视黄酸衍生物、bFGF和LDN-193189的组合，以使DE干细胞分 化为胰细胞或胰细胞前体。 在本专利技术的一个实施方案中，视黄酸受体激动剂或激酶抑制剂的任一个可与bFGF 组合。 本专利技术进一步涉及可通过本专利技术方法获得的胰细胞或胰细胞前体。 本专利技术涉及通过将人多能干细胞暴露于至少一种表1和2所列化合物而产生的胰 细胞或胰细胞前体。 本专利技术涉及表1和2的任何一种化合物从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用 途。 本专利技术涉及LDN-193189从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。 本专利技术涉及LDN-193189随后环巴胺或IWP2从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的 用途。 本专利技术采用一种替代方法以改进人PS细胞向成熟0细胞分化的效率，即通过提 供增加NKX6. 1/H)X1双阳性细胞（PE细胞定型为内分泌细胞命运的标志）分数的方法。 在一方面，本专利技术提供改进的胰细胞群，即NKX6. 1/H)X1双阳性细胞分数增加的 PE〇 此外，本专利技术提供更均质的胰细胞群，这对于这些细胞向内分泌谱系进一步发育 是重要的。 本专利技术还提供更同步的胰群，以到达下一阶段。 本专利技术还可解决将从示例性实施方案的公开内容中显而易见的其它问题。 附图简述 图1显示使用小分子文库的PE筛选方法一也称为文库筛选方法。多能干（PS)细胞根 据DE方案（见通用方法）分化为定形内胚层（DE)并接种在96孔板中用于筛选。胰内胚 层（PE)筛选分为前期和后期。在前期在已发表的基于bFGF的方案（Ameri等，2010，亦 参照W0/2010/136583)中添加化合物进行第一个7天的PE分化，然后无化合物继续另一个 6天。在后期在基于bFGF的方案中，仅在最后6天添加化合物。 图2显示文库筛选方法的前期命中（hit)。将来自人诱导的多能干细胞（hiPSC) (黑色）或hESC(白色）的定形内胚层细胞接种在96孔光学板中并使用14天的基于bFGF 的方案分化为胰内胚层。在基于bFGF的方案中，添加化合物持续14天中的第一个7天并 使用InCell分析仪2000(GEHealthcare)分析NKX6. 1/H)X1双阳性细胞。该图显示与基 准方案相比NKX6.i/roxi双阳性细胞分数的％效果。 图3显示文库筛选方法的后期命中。将来自hiPSC(黑色）或hESC(白色）的定 形内胚层细胞接种在96孔光学板中并使用14天的基于bFGF的方案分化为胰内胚层。在基 于bFGF的方案中，添加化合物持续最后的6天并使用InCell分析仪2000(GEHealthcare) 分析nkx6. i/roxi双阳性细胞。该图显示与基准方案相比nkx6. i/roxi双阳性细胞分数 的％效果。 图4显示第二种基于候选物的PE筛选方法。多能干（PS)细胞根据DE方案（见通 用方法）分化为定形内胚层并接种在96孔板中用于筛选。胰内胚层筛选分为两部分。在筛 选1中，在PE分化的第一个8天将本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生表达至少5% PDX1/NKX6.1双阳性的胰细胞或胰细胞前体的方法，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的下列各组化合物的至少一种：a. BMP抑制剂，和b. 激酶抑制剂，和c. 视黄酸受体激动剂，以使定形内胚层细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J埃克伯格，M汉斯森，U多恩，K赫斯，N富纳，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，宝生物工程欧洲股份公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK