成体干细胞制造技术

一种CD10+、CXCR4+以及CD31+的成体干细胞以及另一种CD105+、CD44+以及巢蛋白(nestin)+的成体干细胞。也揭示制备这些干细胞的方法以及使用它们来治疗退化性疾病，如肌肉退化性疾病，的方法二者。本发明专利技术另外包括制造以及使用由CD105+、CD44+以及巢蛋白+的体细胞衍生而来的肝细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】成体干细胞参考相关申请本申请请求在2011年9月28日提申的美国临时申请第61／540,191号以及在2012年3月12日提申的美国临时申请第61／609,522号的优先权。这两个先前申请的全部内容在此并入本案以为参考。专利技术背景干细胞是可在活体内或试管中分化成许多或所有的细胞类型的全能干(totipotent)细胞、多潜能(pluripotent)干细胞或多能(multipotent)干细胞。由于它们的多潜能性(pluripotency)，一般认为胚胎干(ES)细胞在治疗退化性或先天性疾病方面拥有非常高的潜力。可是道德考虑阻碍了人类ES细胞的使用。非胚胎起源的干细胞可规避此障碍。因此，需要有一种非胚胎干细胞。专利技术概要本专利技术涉及成体干细胞以及相关的方法。本专利技术的一个方面涉及一种CD10+、CXCR4+以及CD31+的分离的体非贴壁干细胞。此细胞在此称作“SB-3细胞”。细胞标记后面的符号“+”，代表与同型的抗体对照组的较低的荧光染色相比，具较多特异性标记抗体的荧光染色。细胞标记后面的符号“-”，代表具有与同型的抗体对照组相同的特异性标记抗体的荧光染色。本专利技术的另一方面涉及一种CD105+、CD44+以及巢蛋白+的分离的体贴壁干细胞。此细胞在此称作“SB-4细胞”。在又另一方面中，本专利技术描述一种细胞库，其包括多受试者干细胞群。该成体干细胞各自为CD10+、CXCR4+以及CD31+，以及该群源自于不同的受试者。该受试者可为人类或非人类。在又另一方面中，本专利技术描述一种细胞库，其包含多受试者干细胞群。该成体干细胞各自为CD105+、CD44+以及巢蛋白+，以及该群源自不同的受试者。该受试者可为人类或非人类。同样在本专利技术的范畴内的是一种用于治疗肌肉损伤或肌肉退化性疾病的方法。该方法包括对需要此治疗的受试者施用一有效量的CD10+、CXCR4+以及CD31+的成体干细胞。该肌肉退化性疾病的例子包括肌营养不良、纤维肌痛、肌肉病变、皮肌炎、多发性肌炎、横纹肌溶解以及心肌炎。本专利技术另外描述另一种用于治疗肌肉损伤或肌肉退化性疾病的方法。该方法包括对需要此治疗的受试者施用一有效量的CD105+、CD44+以及巢蛋白+的成体干细胞。在此也涵盖一种制备成体干细胞的方法。该方法包括1)从一受试者(如，人类或非人类)获得含有多种细胞的体液检体(如，血液、骨髓、脐带血、月经液以及羊水)、2)于容器中用二价阳离子螯合剂(如，EDTA、EGTA以及柠檬酸钠)或肝素培育该检体，直到该检体分成上层以及下层、3)收集该上层、4)从该上层分离出0.3-6.0微米大小的成体干细胞群以及5)在含有特定成长因子：R-Spondin-1、SCF、G-CSF、bFGF、EGF以及PDGF的培养基中培养该分离的成体干细胞。成体干细胞可为CD10、CXCR4以及CD31阳性的。它们也可为CD105、CD44以及巢蛋白阳性的。进一步涵盖的是一种由以上所述的CD105+、CD44+以及巢蛋白+的成体干细胞制备肝细胞的方法。该方法包括在含有激活蛋白的第一分化培养基中培养该分离的成体干细胞；在含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及骨形态发生蛋白2(BMP2)的第二分化培养基中培养该分离的成体干细胞；另外在含有肝细胞生长因子(HGF)、地塞米松(DEX)以及制瘤素M(OSM)的第三分化培养基中培养该分离的成体干细胞；以及收集因此获得的肝细胞，该肝细胞会表达白蛋白、转铁蛋白以及肝细胞核因子3B(HNF3B)。本专利技术也包括一种体外生物人工肝装置。该装置具有一卡匣(cartridge)，其含有一中空纤维阵列以及用以上所述的方法制得的肝细胞。该肝细胞会表达一种或多种选白于由下列所组成的群组的蛋白质：白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、第V因子、补体C3、抗凝血酶III以及转铁蛋白。它们被置于各由孔径约0.1μm至0.3μm的膜形成的中空纤维间的毛细管外空间。该卡匣可具有圆柱形，在接近一端的侧壁上具有第一开口，且在接近另一端的侧壁上也具有第二开口。该第一开口固定至第一通道，而该第二开口固定至第二通道，这两个通道各从该卡匣延伸出去。此外，本专利技术描述一种治疗急性肝衰竭的方法。该方法包括鉴定需要治疗的受试者；通过该第一通道将以上所述的体外生物人工肝装置接到该受试者的动脉，以及通过该第二通道接到该受试者的静脉；从该受试者输注血液通过该卡匣的各中空纤维内部的毛细管空间；以及通过允许从该血液而来的毒素溶解物与培养在该中空纤维间的毛细管外空间的肝细胞交换，使能够净化血液，以及也使从该肝细胞而来的重要代谢物能够扩散至血液返回到该受试者。该受试者可为罹患慢性肝病的人类，它们大部分是因C型肝炎感染、酒精成瘾以及药物过量引起。在一个实施方式中，该受试者正等待肝移植。在此也描述一种产生白蛋白的方法。该方法包括在培养基中培养使用以上所述方法制得的肝细胞，以及从该培养基收集由该肝细胞产生的白蛋白。本专利技术的一个或多个实施方式的详细内容述于所附的图式以及以下的说明书中。本专利技术的其它的特征、目的以及优点因本说明书以及图式以及因申请专利范围而更明白。附图说明图1是显示培养中的SB-3细胞以及SB-4细胞的照片。图2是接到人类受试者的体外生物人工肝装置的概要图。图3a是可用于体外生物人工肝装置的例示卡匣的照片。图3b是例示卡匣的横截面影像。详细说明本专利技术，至少部分，是根据非预期的发现(i)CD10、CXCR4以及CD31为阳性的非贴壁细胞(即，SB-3细胞)可分化成三种胚层；以及(ii)这些细胞可变成CD105、CD44以及巢蛋白为阳性的贴壁细胞(即，SB-4细胞)。SB-3细胞以及SB-4细胞SB-3以及SB-4细胞可从由体液检体(如，血液、骨髓、脐带血、月经液以及羊水)分离出的细胞群制得。该体液检体可获自人类或非人类。从其中可获得以上所提及的成体干细胞的非人类的例子包括，但不限于，灵长类、狗、啮齿动物、豚鼠、猫、马、牛、羊以及猪。的确，涵盖所有的宠物动物、农场动物、实验动物以及疾病模型动物。从一受试者中抽出体液，然后于容器中以二价阳离子螯合剂(如，EDTA、EGTA以及柠檬酸钠)或肝素培育，直到该检体分成上层以及下层。从该上层中分离出0.3-6.0μm大小的成体干细胞群，之后在含有某些成长因子(即，R-Spondin-1、SCF、G-CSF、bFGF、EGF以及PDGF)的培养基中培养，历时1至30天(如，4至14天)。该培养基可含有每一种的浓度1至100ng／ml(如，2至50ng／ml以及5至20ng／ml)。在这些培养条件下，细胞的直径增加至6-25μm。仍未贴壁的细胞为SB-3细胞，而该等变成贴壁的细胞为SB-4细胞。在该SB细胞群中的成体干细胞可为CD9+、SSEA1+、SSEA4+、CD13+或Stro1+。例如，一些为CD9+CD349+。SB-3以及SB-4细胞二者均为成体干细胞。它们可用于再生分化的功能细胞，用于治疗各种退化性病症或组织伤害。这些细胞可容易地在试管中维持以及扩张，以及使用常规技术方法诱导分化。此外，在移植这些细胞进入动物受试者(如，小鼠)之后，没有恶性肿瘤生长的证据。这些干细胞含有正常的染色体配对。它们对谱系诱导剂、增殖剂以及分化抑制剂有反应。由于这些优点，它们可为本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的成体干细胞，其为CD10+、CXCR4+和CD31+。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.28 US 61/540,191;2012.03.12 US 61/609,5221.分离的成体干细胞，其表达CD10+、CXCR4+和CD31+，其中所述成体干细胞表达CD9-，CD349-,CD271-,CD133-,CD66e-,CD45-,CD20-,CD4-，且所述成体干细胞大小为6-25微米。2.权利要求1的分离的成体干细胞，其中所述分离的成体干细胞是多潜能的或多能的。3.权利要求1的分离的成体干细胞，其中所述分离的成体干细胞是非贴壁细胞。4.权利要求1的分离的成体干细胞，其中所述细胞是人细胞。5.权利要求4的分离的成体干细胞，其中所述分离的成体干细胞是多潜能的或多能的。6.权利要求4的分离的成体干细胞，其中所述细胞是非贴壁细胞。7.包含多种成体干细胞群的细胞库，所述成体干细胞每一个表达CD10+、CXCR4+和CD31+，并且所述群来源于不同的受试者，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯·王，
申请(专利权)人：干细胞生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US