用于治疗骨骼缺损的体干细胞制造技术

一种治疗个体内的骨骼缺损的方法，其包含施用有效量的分离的体干细胞至需要其的个体内的骨骼缺损处，其中所述体干细胞大小为大约2至8.0μm且为Lgr5+或CD349+。2至8.0μm且为Lgr5+或CD349+。

【技术实现步骤摘要】
用于治疗骨骼缺损的体干细胞
[0001]本申请是申请日2015年11月18日，国际申请号PCT/US2015/061257、中国申请号201580043614.0，专利技术名称为“用于治疗骨骼缺损的体干细胞”的专利申请的分案申请。
[0002]相关申请案的交叉引述
[0003]本申请案主张2014年11月19日提交的美国专利临时申请案第62/081,880的优先权，其整体内容并入本文以作为参考数据。
专利

[0004]本专利技术有关于用于治疗骨骼缺损的体干细胞。
[0005]专利技术背景
[0006]干细胞为多潜能的或全能的干细胞，其能于活体内或活体外分化成许多的或者全部的细胞谱系。由于其多能性，胚胎干(ES)细胞保有治疗各种各样的疾病的巨大潜力。然而，道德的考虑已妨碍了人类ES细胞的用途。非胚胎起源的干细胞能规避此障碍。这些成体干细胞具有如同ES细胞一样的分化能力。
[0007]已分离源自骨髓的多潜能的成体祖细胞，其能分化成外胚层、中胚层以及内胚层。其他类型的细胞，包括骨髓分离的成体多谱系可诱导的细胞以及衍生自骨髓的单细胞克隆，也具有相同多潜能的分化能力。这些多潜能的体细胞不易获得、培养，及扩增。
专利技术概要
[0008]本文所描述的是一种治疗个体内的骨骼缺损的方法。该方法包括施用有效量的分离的体干细胞至需要其的个体内的骨骼缺损处。该体干细胞大小为大约2至8.0μm且为Lgr5+或CD349+。
[0009]该分离的体干细胞可以通过下列的程序来获得：于容器中以EDTA或肝素来培养源自供体个体的样本直到该样本分离成上层和下层；收集该上层；以及从该上层单离体干细胞群，其大小为大约2至8.0μm且为Lgr5+或CD349+。
[0010]以下的附图及说明中列举一个或更多个实施方案的细节。从本说明及图示，以及从权利要求将更明了该实施方案的其他特征、目的及优点。
[0011]附图简述
[0012]图1为一组影像，其展现出利用SB细胞进行的颅缺损的修复。(A)：阳性和阴性对照。(B)：SB细胞。
[0013]较佳实施例的详细说明
[0014]意外地发现小成体干细胞(small adult stem cells)，也即SB细胞，可以从来自个体的样本分离。SB细胞为多潜能的或全能的干细胞，其能分化成与三种胚胎胚层，即外胚层、内胚层及中胚层，有关联的细胞类型。参见，US2012/0034194。
[0015]从生物样本(例如，骨髓样本)分离的SB细胞大小为大约2至6.0μm，CD133
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、CD34
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、CD90
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、CD66e
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、CD31
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、Lin1
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、CD61
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、Oct4+、Nanog+，以及Sox2
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。在SB细胞群中，有一种独特的细胞亚群，其为CD9
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及Lgr5+(“Lgr5+SB细胞”)。有另一种SB细胞亚群，其为CD9+及CD349+
(“CD349+SB细胞”)。
[0016]SB细胞可以使用下列的程序从样本分离。该样本用EDTA或肝素于容器中(例如，于EDTA管中)培养，直到该样本分离成上层和下层。培养可以在4℃下执行历时6至48小时。由以上的培养步骤生产的上层含有SB细胞(例如，Lgr5+SB细胞及CD349+SB细胞)，其分离可以使用根据细胞大小的方法(例如，离心和过滤)，或者根据细胞表面标志的那些方法(例如，流式细胞术、抗体，以及磁分选)。
[0017]为了富集(enrich)SB细胞，可以从上层中的该细胞群移除Lin+细胞及CD61+细胞。备选地，可以从该细胞群选择Lin
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细胞及CD61
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细胞。Lin+及CD61+细胞可以使用本领域已知的方法予以移除或选择，例如，EasySep Biotin Selection Kit及EasySep PE Selection Kit。
[0018]为了进一步富集SB细胞，在从该个体获得样本之前，可以施用粒细胞集落刺激因子(GCSF)或褐藻糖胶(fucoidan)至该个体。举例而言，在获得样本以前，该个体可以注射以5μg/kg/每天的GCSF历时1至5天。以下所描述的数据显示GCSF可以动员SB细胞。GCSF
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动员的SB细胞的大小稍微大一些，也即，大约4至8μm。
[0019]SB细胞可以从样本分离，例如血液、骨髓、骨骼肌，或者脂肪的组织样本。在样本为一种骨骼肌或者脂肪组织样本的一个实施方案中，在培养步骤以前，组织样本首先可以用胶原蛋白酶来消化以从细胞外的基质释放个别的细胞。该样本可以获得自人类个体。
[0020]分离的SB细胞，Lgr5+SB细胞，或者CD349+SB细胞可以于非分化培养基中进一步增殖超过10、20、50，或者100群倍增，而没有显示自发性的分化、衰老、形态变异、增高的生长速率，或者分化能力改变的情况。这些干细胞在使用前可以用标准的方法予以储存。
[0021]术语“干细胞”系是指一种细胞，其为全能或多潜能的，也即能够分化成一些最终的、分化细胞类型。全能干细胞典型地具有发展成任一种细胞类型的能力。全能的干细胞的起源可以为非胚胎。多潜能的细胞典型为细胞，其能够分化成数种的不同的、最终分化的细胞类型。单潜能干细胞仅可以生产一种细胞类型，但是其具有能与非干细胞区分的自我更新的性质。这些干细胞可以发源自各种各样的组织或者器官系统，包括血液、神经、肌肉、皮肤、肠、骨骼、肾脏、肝脏、胰脏、胸腺，以及类似物。
[0022]本文中所公开的干细胞为实质纯的。术语"实质纯的"，当参照干细胞或者干细胞衍生的细胞(例如，分化的细胞)来使用时，意指该特定的细胞组成制备物中多数的细胞(也即，超过20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或者95％)。一般说来，一种实质纯化的细胞群组成制备物中至少大约70％的细胞，通常为制备物中大约80％的细胞，以及特别地为制备物中至少大约90％的细胞(例如，95％、97％、99％或者100％)。
[0023]当在本文中可交换地使用时，有关于细胞的术语"增生(proliferation)"和"扩增(expansion)”，意指相同类型的细胞数目通过分裂而增加。术语"分化"是指一种发展过程，通过此发展过程细胞变成特化成一种特定的功能，举例而言，细胞获得与最初的细胞类型相异的一种或多种形态特征及/或功能。术语"分化"包括谱系确定(lineage commitment)及终末分化(terminal differentiation)过程二者。分化的评估可以，举例而言，通过使用免疫组织化学法或者本领域技术人员已知的其他程序，来监测存在或者缺少谱系标志。衍生自祖细胞的分化的后代细胞可以，但是非必需，相关于干细胞的来源组织相同的胚层或者组织。举例而言，神经祖细胞及肌肉祖细胞可以分化成造成血细胞谱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分离的体干细胞在制备用于治疗个体内的骨骼缺损的药物中的用途，其中所述体干细胞大小为2至8.0μm且为Lgr5+，其中将所述分离的体干细胞施用至骨骼缺损处，且其中Lin+细胞和CD61+细胞已经从所述分离的体干细胞移除。2.如权利要求1所述的用途，其中所述体干细胞为CD133
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、CD34
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、CD90
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、CD66e
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、CD31
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、Lin1
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、CD61
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、Oct4+、Nanog+，以及Sox2
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。3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述体干细胞通过下列的程序来获得：于容器中以EDTA或肝素培养源自供体个体的样本直到所述样本分离成上层和下层，收集所述上层，以及从所述上层分离体干细胞群，其大小为2至8.0μm且为Lgr5+。4.如权利要求3所述的用途，其中所述样本为...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯，
申请(专利权)人：干细胞生物科技公司，
类型：发明
国别省市：