一种干细胞制剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，将目的干细胞与氧化铁纳米粒共孵育刺激培养一定时间后，通过外磁场分离去除未摄取氧化铁纳米粒的目的干细胞后，制得干细胞制剂，所述的干细胞制剂具有对损伤细胞进行选择性高效线粒体转运的能力。相比于天然干细胞制剂，本发明专利技术所述的干细胞制剂具有明显提高针对损伤细胞进行线粒体移植的能力，提高效率在2倍以上。本发明专利技术还公开了所述的干细胞制剂在制备治疗与线粒体受损相关疾病的制剂中的应用，所述的干细胞制剂可以靶向受损细胞进行线粒体移植治疗，显著降低损伤细胞内过高的活性氧水平，恢复胞内ATP供能，保护和修复损伤细胞，最终实现相关疾病的有效治疗。最终实现相关疾病的有效治疗。最终实现相关疾病的有效治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞制剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物学
，具体涉及一种干细胞制剂及其制备方法和在线粒体靶向移植中的应用。

技术介绍

[0002]线粒体是细胞内的主要供能单位，在维持细胞正常的生理功能中发挥着重要作用。近年来的一系列研究都表明，许多疾病，如阿尔茨海默症，急性肺损伤、心肌缺血、糖尿病肾病、以及脊髓损伤等的发生或发展都与病理刺激引起的线粒体损伤和随后导致的细胞生理功能紊乱密切相关。当细胞因外界因素刺激受到损伤时，其线粒体功能往往会发生异常，导致胞内正常的呼吸链电子传递效率降低，活性氧(ROS)产生增多，线粒体生物生成减少，线粒体DNA受损，线粒体自噬受到抑制等。最终，使得胞内ROS的产生与消耗的动态平衡被打破，无法继续维持细胞正常的生理功能，并逐渐导致细胞的病变和凋亡。
[0003]通过向上述线粒体受损的细胞移植健康线粒体，来重新恢复这些细胞的有氧呼吸功能和电子传递链效率，减少受损细胞的ROS产生，提高ATP供能和钙缓冲能力，保护和修复受损细胞，进而实现疾病治疗或者缓解疾病病程发展的线粒体移植治疗在近年被逐渐证明是一种可行的新型疾病治疗方案。然而，如何将健康的线粒体在体内靶向运输至受损细胞，并且保持这些健康线粒体在体内传递过程中的活性和对受损细胞的高效线粒体转运却成为当前线粒体移植治疗策略面临的一个重要瓶颈问题。
[0004]目前，国内外主要的线粒体移植治疗方案是：体外从健康细胞内提取和纯化线粒体，再通过一定的技术将这些线粒体注射至疾病部位，从而实现线粒体的移植治疗。但是，这一治疗方案在实际临床应用中却面临着许多问题和诸多限制。首先，线粒体自身的提取和纯化过程对于线粒体的活性会带来一定的不利影响，且游离的线粒体在体外的存活时间很短，往往只有数小时，这就使得需要尽快将新鲜线粒体注射至患者体内以保证疗效，这也极大限制了这一治疗策略在临床上应用的灵活性和可操作性。此外，向疾病部位注射线粒体的方式，其移植效率并不十分高效。并且，这种直接注射线粒体方式并不能有效保证线粒体只被移植至疾病部位的受损细胞，还有可能被一些其他细胞摄取，引起潜在的安全风险。
[0005]一些最新研究结果显示，在病理条件下线粒体可以在不同细胞间进行自发的转运，从而起到对受损细胞一定的保护和修复作用。并且，这种线粒体转运在正常细胞间通常发生概率很低，只有当细胞受到病理性刺激后才会引起线粒体的转运。这一生理机制为通过细胞间的线粒体转运来实现靶向受损细胞的选择性线粒体移植提供了新的可能。另一方面，已有许多研究显示，一些干细胞，如间充质干细胞或者神经干细胞等具有向受损组织进行归巢的特性，因而可以利用干细胞来作为新型的细胞载体靶向递送系统实现对受损细胞的高效药物传递。目前也有研究显示，干细胞不但具有高效的线粒体生物生成能力，还具有向受损细胞单向转运健康线粒体的能力。上述这些特性为利用干细胞来制备线粒体的供体细胞制剂，实现体内对受损细胞的靶向线粒体移植提供了可能，从而巧妙地解决上述线粒体移植治疗面临的主要瓶颈问题。
[0006]但是，干细胞在生理条件下的线粒体转运效率却并不十分高效。有研究显示其转运效率通常不足10％。这种较低的线粒体转运效率使得无法使用天然的干细胞来制备干细胞制剂进行线粒体的移植治疗。而另一方面，线粒体受损导致的细胞生理功能紊乱往往是一个快速发展的过程，需要健康线粒体的高效补充才有可能有效补偿不断丧失的线粒体功能，挽救持续凋亡的受损细胞。
[0007]因此，研发一种具有高效线粒体转运能力的干细胞制剂，来实现体内靶向受损细胞的高效线粒体移植，就有望为解决当前线粒体移植治疗面临的诸多难题提供一种切实可行的解决方案。同时，有望为临床一些难治性疾病的治疗提供一种新的基于线粒体移植的治疗策略和可行的干细胞制剂，具有十分重要的科学研究价值和临床治疗意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于针对现有的线粒体移植治疗技术面临的线粒体活性保持、对受损细胞的选择性转运和线粒体转运效率低下等瓶颈问题，提供了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，通过氧化铁纳米粒刺激培养制备具有选择性向损伤细胞进行高效线粒体转运能力的干细胞制剂。
[0009]本专利技术解决上述技术问题所提供的技术方案为：
[0010]一种干细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：将目的干细胞与氧化铁纳米粒共孵育刺激培养一定时间后，通过外磁场分离去除未摄取氧化铁纳米粒的目的干细胞后，制得干细胞制剂，所述的干细胞制剂具有针对损伤细胞进行选择性高效线粒体转运的能力。
[0011]所述目的干细胞为多能性干细胞或成体干细胞。
[0012]所述氧化铁纳米粒为四氧化三铁纳米粒或含有四氧化三铁的复合纳米粒。
[0013]上述技术方案中，对于氧化铁纳米粒的尺寸，形貌和表面聚合物修饰等无特殊要求，但要求氧化铁纳米粒为四氧化三铁纳米粒或者含四氧化三铁的复合纳米粒，以保证氧化铁纳米粒被干细胞摄取和降解后在胞内产生一定量的亚铁离子。同时，所使用的氧化铁纳米粒还需能够在水相体系中稳定分散，并能被干细胞高效摄取，且对干细胞具有良好的相容性，无细胞毒性和不影响干细胞分化和迁移等基本干细胞功能。
[0014]所述的氧化铁纳米粒的尺寸为1～800nm。
[0015]所述氧化铁纳米粒优选为表面带正电荷的单分散四氧化三铁纳米粒，所述氧化铁纳米粒的尺寸优选为5～50nm。
[0016]所述氧化铁纳米粒进一步优选为表面带正电荷的亚铁磁性四氧化三铁纳米立方体，所述氧化铁纳米粒的尺寸进一步优选为10～25nm。
[0017]所述的尺寸为球形氧化铁纳米粒的直径或者正方形氧化铁纳米粒的边长。
[0018]所述的共孵育的具体步骤为：
[0019](1)将浓度不超过100μg/mL的氧化铁纳米粒与目的干细胞在无血清或者有血清的条件培养基下进行刺激培养1～6h；
[0020](2)在刺激培养后，用缓冲液洗去多余的氧化铁纳米粒，更换为新鲜的含血清条件培养基继续培养目的干细胞12h以上；
[0021](3)消化步骤(2)中继续培养后的目的干细胞，并重悬于中性磷酸缓冲液(PBS)中，收集得到细胞悬液，细胞悬液置于外磁场下20～40min，除去未摄取氧化铁纳米粒的目的干
细胞后，获得所述的干细胞制剂。
[0022]所述氧化铁纳米粒与干细胞共孵育刺激培养，指将适宜浓度的氧化铁纳米粒加入目的干细胞，在37℃，5％二氧化碳下进行共孵育培养，一定时间后，换回新鲜的条件培养基继续培养，获得具有高效线粒体转运能力的干细胞制剂。
[0023]所述氧化铁纳米粒浓度优选为5～80μg/mL，以避免引起细胞毒性。所述氧化铁纳米粒浓度更优选为8～12μg/mL，制得的干细胞制剂具有最优的线粒体转运效率。
[0024]所述氧化铁纳米粒与目的干细胞之间的比例为0.2～2μg氧化铁纳米粒对应每一万个目的干细胞。
[0025]所述的刺激培养的时间优选为1～4h，以实现氧化铁纳米粒被目的干细胞的有效摄取。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将目的干细胞与氧化铁纳米粒共孵育刺激培养一定时间后，通过外磁场分离去除未摄取氧化铁纳米粒的目的干细胞后，制得干细胞制剂，所述的干细胞制剂具有对损伤细胞进行选择性高效线粒体转运的能力。2.根据权利要求1所述的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述目的干细胞为多能性干细胞或成体干细胞。3.根据权利要求1所述的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述氧化铁纳米粒为四氧化三铁纳米粒或含有四氧化三铁的复合纳米粒。4.根据权利要求1所述的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述的氧化铁纳米粒的尺寸为1～800nm。5.根据权利要求1所述的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述的共孵育刺激培养的具体步骤为：(1)将浓度不超过100μg/mL的氧化铁纳米粒与目的干细胞在无血清或者有血清...

【专利技术属性】
技术研发人员：高建青，张添源，黄婷，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：