用于原发性线粒体疾病的线粒体增强疗法制造技术

本发明专利技术提供了富集有功能性线粒体的人类干细胞，其中健康的功能性外源线粒体占线粒体富化的人类干细胞中总线粒体的至少3％并少于33％。还公开了生产此类细胞的方法及其用于治疗原发性线粒体疾病的用途。疗原发性线粒体疾病的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于原发性线粒体疾病的线粒体增强疗法


[0001]本专利技术涉及哺乳动物干细胞，更特别是富集有外源功能性人类线粒体的人类干细胞。本专利技术还涉及它们的生产方法和利用此类富集细胞的治疗方法。

技术介绍

[0002]线粒体是存在于大多数真核细胞中，直径在0.5至1.0μm范围内的膜约束的细胞器。线粒体存在于几乎所有真核细胞中，其数目和位置随着细胞类型而变。线粒体含有它们自己的DNA(mtDNA)和自己的用于合成RNA和蛋白质的机制。mtDNA仅含有37个基因，因此哺乳动物体内的大多数基因产物由核DNA编码。
[0003]线粒体在真核细胞中执行大量必不可少的任务，例如丙酮酸氧化、克雷布斯循环以及氨基酸、脂肪酸和甾类的代谢。然而，线粒体的主要功能是利用电子传递链和氧化磷酸化系统(“呼吸链”)产生作为三磷酸腺苷(ATP)的能量。线粒体参与的其他过程包括产热、钙离子储存、钙信号传导、程序化细胞死亡(凋亡)和细胞增殖。因此，在本领域中已知许多与线粒体的功能障碍或功能紊乱相关的需要治疗的疾病和障碍。
[0004]细胞内的ATP浓度通常为1
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10mM。ATP可以使用单糖和复合糖(碳水化合物)或脂类作为能源通过氧化还原反应来生产。对于将要用于合成ATP的复杂燃料来说，首先需要将它们分解成更小的、更简单的分子。复杂的碳水化合物被水解成单糖例如葡萄糖和果糖。脂肪(甘油三酯)被代谢以给出脂肪酸和甘油。
[0005]将葡萄糖氧化成二氧化碳的总过程被称为细胞呼吸，并且从单个葡萄糖分子可以产生约30个ATP分子。ATP可以通过大量不同的细胞过程产生。在真核生物体中用于产生能量的三个主要途径是糖酵解和柠檬酸循环/氧化磷酸化(两者均为细胞呼吸的组分)以及β
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氧化。非光合好氧真核生物的这种ATP生产大部分发生在线粒体中，所述线粒体可以占典型细胞总体积的接近25％。
[0006]线粒体疾病是由功能障碍的线粒体引起的一类疾病。原发性线粒体疾病可能由线粒体DNA中影响线粒体功能的突变或由核DNA的基因(所述基因的产物被输入到线粒体中(线粒体蛋白))中的突变引起。线粒体疾病具有独特的特征，这既因为所述疾病的方式通常是遗传性的，也因为线粒体对细胞功能至关重要。这些疾病的具有神经肌肉疾病症状的亚类通常被称为线粒体肌病。不同于原发性线粒体疾病，也被称为获得性线粒体功能障碍的继发性线粒体功能障碍可以由核DNA的不直接参与线粒体氧化磷酸化级联的基因引起。受影响的基因既不编码线粒体蛋白，也不通过影响运行氧化磷酸化(OXPHOS)过程所需的复杂机构的生产而影响OXPHOS。继发性线粒体功能障碍可能伴随许多疾病或障碍例如脂肪性肝病、心肌梗塞和中风，并且也可能是在可以造成氧化胁迫的不利环境或药物相关的效应之后获得的。后者可能造成mtDNA改变和/或功能障碍的线粒体，正如在不利地影响线粒体的各种其他过程例如衰老、炎性反应、线粒体毒性药物等中所看到的。
[0007]在受影响的线粒体数目达到某个水平后，线粒体疾病可能变得临床上明显；这种现象被称为“异质性阈值”。由于不高效的错误检查能力，并且由于DNA是裸露的且没有像核
组蛋白那样的保护，线粒体DNA突变频繁地发生。这意味着线粒体DNA障碍可能自发且相对经常地发生。控制线粒体DNA复制的酶(它们都由核DNA中的基因编码)中的缺陷也可能引起线粒体DNA突变。大多数线粒体功能和生物发生由核DNA控制。人类线粒体DNA仅编码13种呼吸链的蛋白，而靶向线粒体的据估计1,500种蛋白和组分中的大多数是核编码的。核编码的线粒体基因中的缺陷与包括贫血、痴呆、癫痫、糖尿病、肌病、高血压、淋巴瘤、视网膜病、癫痫发作和神经发育障碍在内的广范围的临床疾病表型相关。
[0008]皮尔逊综合症(PS)是一种以骨髓失效、贫血和胰腺功能障碍为特征的线粒体疾病。其他临床特点是成长停滞、伴有胰岛素依赖型糖尿病和外分泌型胰腺缺乏症的胰腺纤维化、肾功能不全、肌肉和神经系统损伤。存活到成年的少数患者经常出现Kearns
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Sayre综合征(KSS)的症状。
[0009]肾范可尼综合征或范可尼综合征是一种肾的近端肾小管重吸收不足的综合征。所述综合征可以由各种不同的潜在先天性或获得性疾病、毒性或药物不良反应引起。这导致代谢的各种不同小分子通行进入到尿液中，而不是从肾小管液中重吸收。
[0010]KSS是一种线粒体肌病，是慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO)的更严重的综合征变型，是一种以孤立地涉及控制眼和眼睑移动的肌肉为特征的综合征。KSS引起上睑下垂和眼肌麻痹。KSS包括眼中的CPEO和色素性视网膜病以及心脏传导异常的组合。其他症状可能包括小脑共济失调、近端肌无力、耳聋、糖尿病、生长激素缺乏症和甲状旁腺功能减退。
[0011]Leber遗传性视神经病变(LHON)或Leber视神经萎缩是一种视网膜神经节细胞(RGC)和它们的轴突的线粒体遗传(从母亲传递到子代)的变性，其引起中央视力的急性或亚急性丧失，主要影响年轻的成年男性。然而，LHON只通过母亲传递，因为它主要由线粒体(而非核)基因组中的突变所致，并且只有卵子将线粒体贡献给胚胎。LHON通常由三种致病性线粒体DNA(mtDNA)点突变之一造成。这些突变分别是线粒体中氧化磷酸化链的复合物I的ND4、ND1和ND6亚基基因中的第11778位核苷酸从G突变为A、第3460位核苷酸从G突变为A和第14484位核苷酸从T突变为C。这些突变可以导致细胞能量产生的减少，进而导致细胞损伤和某些视神经细胞的死亡。目前，专家无法确定哪些家庭成员会出现症状，尽管平均有50％的具有LHON突变的男性和15％的具有LHON突变的女性在他们的一生中会失去视力。
[0012]线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作，缩写为MELAS，是也包括MERRF和Leber遗传性视神经病变的线粒体细胞病家族的成员之一。所述疾病可以在两种性别中均表现出来。MELAS由线粒体DNA中的基因突变引起。在MELAS中受影响的一些基因(MT
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ND1、MT
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ND5)编码作为线粒体中NADH脱氢酶(也被称为复合物I)的一部分的蛋白质，所述脱氢酶有助于将氧气和单糖转化为能量。其他基因(MT
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TH、MT
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TL1和MT
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TV)编码线粒体特异性转移RNA(tRNA)。MT
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TL1中的突变引起所有MELAS病例中80％以上的病例。它们损害线粒体制造蛋白质、使用氧气和产生能量的能力。
[0013]线粒体呼吸链障碍(MRCD)是一组非均质的障碍，由于影响线粒体氧化磷酸化系统(OXPHOS)的分子缺陷，所述障碍共享细胞生物能机制的参与。尽管它们倾向于主要影响神经系统和骨骼肌，但在临床上它们通常涉及多个组织。心脏病表现很常见，并包括作为成人或婴儿多系统线粒体障碍的一部分的肥厚性或扩张性心肌病和心脏传导缺陷，或不太常见的情况下表现为孤立的临床病症。在某些实施方式中，所述线本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在需要治疗的人类患者中治疗原发性线粒体疾病、障碍或其症状的药物组合物，所述组合物包含在能够支持细胞生存的可药用液体介质中的至少105至2x107个人类干细胞/千克患者体重，其中所述人类干细胞富集有冻融过的、在线粒体DNA中没有致病突变的健康的功能性人类外源线粒体，并且其中所述健康的功能性人类外源线粒体占线粒体富化的人类干细胞中总线粒体的至少3％并少于33％。2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述富集包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.088直至176毫单位CS活性/百万个细胞的线粒体。3.权利要求2所述的药物组合物，其中所述富集包括将所述干细胞与剂量为0.88直至17.6毫单位CS活性/百万个细胞的线粒体相接触。4.权利要求1至3中的任一项所述的药物组合物，其中所述健康的功能性人类外源线粒体是同系或同种异体的。5.权利要求1至4中的任一项所述的药物组合物，其中所述人类干细胞是CD34
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。6.权利要求1至5中的任一项所述的药物组合物，其中所述原发性线粒体疾病或障碍与线粒体DNA中的突变相关。7.权利要求6所述的药物组合物，其中与线粒体DNA中的突变相关的所述原发性线粒体疾病或障碍选自皮尔逊综合症，Kearns
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Sayre综合征，线粒体脑病乳酸性酸中毒和中风样发作(MELAS)综合征，Leber遗传性视神经病变(LHON)，神经病、共济失调和色素性视网膜炎(NARP)综合征，肌阵挛性癫痫伴蓬毛样红纤维(MERRF)综合征，母体遗传性糖尿病和耳聋(MIDD)，Alpers样综合征，慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO)，先天性乳酸性酸中毒(CLA)的线粒体DNA相关形式，线粒体DNA耗竭综合征(MDDS)和Leigh综合征的线粒体DNA相关形式。8.权利要求1至5中的任一项所述的药物组合物，其中所述原发性线粒体疾病或障碍与核DNA中的突变相关。9.权利要求8所述的药物组合物，其中与核DNA中的突变相关的所述原发性线粒体疾病或障碍选自线粒体神经胃肠脑病(MNGIE)综合征，Alpers综合征，弗里德希氏共济失调(FA)，进行性眼外肌麻痹(PEO)，铁粒幼细胞性贫血，共济失调性神经病变综合征(ANS)，孟德尔神经变性线粒体病，3
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甲基戊烯二酸尿症(MEG)伴耳聋(D)、脑病(E)和Leigh样病(L)综合征(MEGDEL)，Sengers综合征，微小病变型肾病综合征(MCNS)，先天性乳酸性酸中毒(CLA)的核DNA相关形式，线粒体DNA耗竭综合征(MDDS)和Leigh综合征的核DNA相关形式。10.权利要求1至9中的任一项所述的药物组合物，其中所述原发性线粒体疾病或障碍与选自肾、肝、脑、肌肉、胰腺、眼及其任何组合的器官相关。11.权利要求1至10中的任一项所述的药物组合物，其中所述症状选自行走能力受损、运动技能受损、语言技能受损、记忆受损、体重增加受损、成长停滞、血液碱性磷酸酶水平低、血镁水平低、血液肌酐水平高、血液碳酸氢盐水平低、血液碱过量水平低、尿液葡萄糖/肌酐比率高、尿液氯化物/肌酐比率高、尿液钠/肌酐比率高、血液乳酸水平高、尿液镁/肌酐比率高、尿液钾/肌酐比率高、尿液钙/肌酐比率高、糖尿、镁尿、血液尿素水平高、C
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肽水平低、HbA1C水平高、甲状旁腺功能减退、上睑下垂、听觉损失、心脏传导障碍、癫痫发作、中风样发作、EEG受损、血液天冬氨酸转氨酶(AST)水平高、血液丙氨酸转氨酶(ALT)水平高、淋巴细胞中ATP含量和氧消耗量低。12.权利要求1至11中的任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被给药到特定
组织或器官。13.权利要求1至11中的任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物通过系统性给药来给药。14.权利要求13所述的药物组合物，其包含约106个线粒体富化的人类干细胞/千克患者体重。15.权利要求1至12中的任一项所述的药物组合物，其包含总共约5x105至5x109个线粒体富化的人类干细胞。16.权利要求1至15中的任一项所述的药物组合物，其中所述线粒体富化的人类干细胞具有下述中的至少一者：相对于线粒体富集之前的干细胞中的相应水平(i)提高的线粒体DNA含量；(ii)提高的CS活性水平；(iii)提高的选自SDHA和COX1的至少一种线粒体蛋白的含量；(iv)提高的O2消耗速率；(v)提高的ATP生产速率；或(vi)其任何组合。17.权利要求1至16中的任一项所述的药物组合物，其中所述人类干细胞在用所述外源线粒体富集之前获自或源自于所述患者。18.权利要求1至16中的任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：娜塔莉，
申请(专利权)人：米诺维亚疗法有限公司，
类型：发明
国别省市：