本发明专利技术涉及具有过氧化酶活性的分离的多肽以及编码多肽的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包含多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用多肽的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及具有过氧化酶活性的分离的多肽以及编码多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及包含多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用多肽的方法。【专利说明】具有过氧化酶活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸对序列表的引用本申请包含计算机可读形式的序列表，其并入本文以作参考。
本专利技术涉及具有过氧化酶(peroxygenase )活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及包含该多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用多肽的方法。
技术介绍
W02008/119780公开了八种不同的来自茶树燕(Agrocybe aegerita)、灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)、双色腊蘑(Laccaria bicolor)和福毛鬼伞(Coprinus radians)的过氧化酶。Ullrich 等人,Appl.Env.Microbiol.(2004) 70 (8): 4575-4581 公开了来自伞菌担子菌菌株茶树菇(菌株TM-Al)的过氧化酶，发现该酶氧化芳基醇类和醛类。W02006/034702公开了使用茶树菇TM Al的AaP过氧化酶对未活化的烃诸如萘、甲苯和环己烧进行酶促轻化的方法。这也描述于Ullrich and Hofrichter, FEBSLetters (2005)579:6247-6250。DE10332065A1公开了通过使用茶树菇TM Al的AaP过氧化酶经由醛类的中间形成从醇类酶法制备酸的方法。报道了迅速且选择性分光光度法`直接检测经AaP过氧化酶的芳族羟化的方法(Kluge 等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.(2007) 75:1473-1478)。众所周知，将氧官能团直接区域选择性引入有机分子(氧合)在化学合成中构成问题。产物可在各种不同的合成中用作重要的中间体。W02011/120938公开了使用各种过氧化酶在取代的或未取代的、直链的或支链的脂族烃的2位或3位进行酶促羟化的方法。本专利技术提供具有过氧化酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。
技术实现思路
本专利技术涉及具有过氧化酶活性的分离的多肽，其选自:(a)与SEQ ID NO: 2的成熟多肽具有至少60%序列同一性的多肽；(b)由在中等严格条件下与(i) SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(^)其00嫩序列；*(iii)，(i)或(ii)的全长互补物杂交的多核苷酸所编码的多肽；(C)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60%序列同一性的多核苷酸所编码的多肽；(d)在一个或多个(例如，若干个)位置包含替换、缺失和/或插入的SEQ ID N0:2的成熟多肽的变体；以及(e), (a)、(b)、(c)或(d)多肽的具有过氧化酶活性的片段。本专利技术还涉及编码本专利技术多肽的分离的多核苷酸；包含该多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞；以及制备该多肽的方法。本专利技术还涉及使用本专利技术的多肽的方法。本专利技术还涉及编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸-17至-1或由SEQ ID NO:2的氨基酸-17至-1组成的信号肽的多核苷酸，该多核苷酸与编码蛋白的基因可操作地连接；包含多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；以及生产蛋白的方法。【具体实施方式】定义:过氧化酶:术语“过氧化酶”根据ECl.11.2.1意指“非特异性过氧化酶”活性，其催化氧原子从H2O2插入广泛种类的底物，如4-硝基苯并二氧杂环戍烯(4-nitrobenzodioxole)。出于本专利技术的目的，根据实施例3中描述的步骤或 M.Poraj-Kobielska, M.Kinne, R.Ullrich, K.Scheibner, M.Hofrichter, “Aspectrophotometric assay for the detection of fungal peroxygenases，，(用于真菌过氧化酶检测的分光光度测定),Analytical Biochemistry (2012), vol.421, issuel, pp.327 - 329中的步骤来确定过氧化酶活性。一方面，本专利技术的多肽(过氧化酶)具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的过氧化酶活性的至少20%，如，至少4 0%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少 100% 等位变体(allelic variant):术语“等位变体”是指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种可选形式中的任一种。等位变化天然地通过突变产生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽无变化)，或者可以编码氨基酸序列改变的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体所编码的多肽。cDNA:术语“cDNA”是指可以通过逆转录由从真核或原核细胞得到的成熟的、已剪接的mRNA分子制备而来的DNA分子。cDNA缺少可存在于对应基因组DNA中的内含子序列。最初的初级RNA转录物是mRNA的前体，其在呈现为成熟的、已剪接的mRNA之前，通过一系列包括剪接在内的步骤进行加工。编码序列:术语“编码序列”是指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，开放阅读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始并以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其组合。控制序列:术语“控制序列”是指对于编码本专利技术成熟多肽的多核苷酸的表达为必需的核酸序列。各个控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是内生的(native) (B卩，来自相同基因)或外来的(foreign)(即，来自不同基因)，或者对于彼此是内生或外来的。这些控制序列包括但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最小程度地，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入特定的限制性酶切位点以促进控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的目的，控制序列可设有接头(linker)。表达:术语“表达”包括多肽生产中所涉及的任何步骤，包括但不限于:转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。表达载体:术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸、并与用于其表达的控制序列可操作地连接的线性或环状DNA分子。片段:术语“片段”是指有一个或多个(例如，若干个)氨基酸从成熟多肽或结构域的氨基端和/或羧基端缺失的多肽或催化结构域；其中该片段具有过氧化酶活性。一方面，片段包含至少220个氨基酸残基(如，SEQ ID NO:2的氨基酸I至220)、至少230个氨基酸残基(如，SEQ ID NO:2的氨基酸I至230)、或至少240个氨基酸残基(如，SEQ ID NO:2的氨基酸I至240)。高等严格条件:术语“高等严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针，在42°C下在5XSSPE、0.3%SDS、200 μ g/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交并杂交，遵循标准Southern印迹过程进行12~24个小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2%SDS在65 °C下清洗三次，每次15分钟。宿主细胞:术语“宿主细胞”是指对于用包含本专利技术多核本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有过氧化酶活性的分离的多肽，其选自：（a）与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽；（b）由在中等严格条件、中‑高等严格条件、高等严格条件、或极高等严格条件下与（i）SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；（ii）其cDNA序列；或（iii），（i）或（ii）的全长互补物杂交的多核苷酸所编码的多肽；（c）由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多核苷酸所编码的多肽；（d）在一个或多个位置包含替换、缺失和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体；以及（e），（a）、（b）、（c）或（d）多肽的具有过氧化酶活性的片段。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·兰德维克，L·H·厄斯特高，L·卡卢，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK
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