产头孢菌素G的重组菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了产头孢菌素G的重组菌及其构建方法与应用。本发明专利技术的产头孢菌素G的重组菌的构建方法，包括将扩环酶基因导入受体菌得到产头孢菌素G的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌。实验证明，本发明专利技术所制备的产头孢菌素G的重组菌的头孢菌素G的产量为2.67mM-29.01mM即(0.89-9.64g/L)。

【技术实现步骤摘要】
产头孢菌素G的重组菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及产头孢菌素G的重组菌及其构建方法与应用。
技术介绍
7－氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-Amino-3-DesacetoxyCephalosporanicAcid，7-ADCA）是头孢菌素的母核，是制备头孢氨苄、头孢拉定和头孢羟氨苄等头孢类抗生素的重要中间体之一。7-ADCA的工业合成方法主要包括两个步骤：（1）青霉素G化学扩环生成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸，又称苯乙酰-7-ADCA或头孢菌素G（phenylacetyl-7-ADCA，G-7-ADCA，DAOG)；（2）G-7-ADCA经青霉素G酰化酶催化脱去侧链得到7-ADCA。对脱去侧链的步骤已经有充分的研究，而扩环反应成为合成工艺中的重要研究方向。通过化学法进行扩环反应存在复杂、成本高，且副产品和有机溶剂对环境不利等缺点，因此，急需使用一种对环境友好的方法来代替化学扩环法。扩环酶(Expandase)又叫脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶(DeacetoxycephalosporinCSynthetase,DAOCS)催化青霉素的五员噻唑环氧化扩环形成头孢菌素的六员噻嗪环,是头孢菌素生物合成的关键酶。来自顶头孢（C.acremonium）、棒状链霉菌（Streptomycesclavuligerus）、耐内酰胺诺卡氏菌（NocardiaLactamdurans）的DAOCS已经被克隆表达和表征。但DAOCS的天然底物是青霉素N，难以大量获得，此外即使青霉素N扩环成功，其侧链也很难用酰化酶切除。因此，人们以廉价的青霉素G为原料开展了向头孢菌素转化的研究。通过对DAOCS进行了随机和定向突变，希望其能够转化低廉且易获得的原料青霉素G，实现头孢菌素C的大规模生产，虽然酶的改造取得了很大的进展，但酶法制备头孢菌素发展缓慢。主要是由于在DAOCS在体外不稳定，转化效率低，且反应需要α-酮戊二酸作为辅因子，导致酶法制备头孢菌素的成本较高。全细胞生物转化是一种高效、绿色的生物转化过程，已成功运用在多种产品的工业化生产上。全细胞催化通过细胞壁的保护使酶更加稳定，并且可以利用细胞内的辅因子，从而降低催化剂的成本，提高生物催化的效率。ArnoldL.Demian研究组用棒状链霉菌或变铅青链霉菌（Streptomyceslividans）进行生产G-7-ADCA，但产量最高为0.2g/L。（DemainAL,Báez-VásquezMA.2000.ImmobilizedStreptomycesclavuligerusNP1cellsforbiotransformationofpenicillinGintodeacetoxycephalosporinG.Appliedbiochemistryandbiotechnology87:135-40；GaoQ,PiretJ,AdrioJ,DemainA.2003.PerformanceofarecombinantstrainofStreptomyceslividansforbioconversionofpenicillinGtodeacetoxycephalosporinG.JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology30:190-4）。随着我国青霉素的发酵技术水平的提高，生产成本不断降低，青霉素的生产能力不断增大，除了出口和国内临床使用外，尚有较多余量，因此以廉价青霉素为原料开发头孢菌素类抗生素是值得重视的途径。特别是全细胞催化法青霉素G产G-7-ADCA值得深入研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是提供头孢菌素G（G-7-ADCA）产量高的产头孢菌素G（G-7-ADCA）的重组菌及其构建方法。本专利技术所提供的产头孢菌素G的重组菌的构建方法，包括将扩环酶基因导入受体菌得到产头孢菌素G的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌。上述方法中，所述突变型大肠杆菌为下述A1至A8中的任一种：A1、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行下述a1-a4的改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG22）；a1、将α－酮戊二酸脱氢酶基因敲除，该改造以“△sucA”表示；a2、将异柠檬酸裂合酶基因敲除，该改造以“△aceA”表示；a3、将β－内酰胺酶基因敲除，该改造以“△ampC”表示；a4、用乙酰辅酶A合成酶基因（acs）替换丙酮酸氧化酶基因（poxB），该改造以“△poxB::acs”表示；A2、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1、所述a3和所述a4改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG15）；A3、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1和所述a3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG14）；A4、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1、所述a2和所述a3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG20）；A5、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1和所述a4改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG03）；A6、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1、所述a2和所述a4改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG05）；A7、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG01）；A8、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1和所述a2改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG16）。上述敲除和替换均可通过同源重组实现。上述方法中，所述扩环酶基因可编码b1和b2的蛋白质：b1、由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b2、在SEQIDNo.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶活性的由b1）衍生的蛋白质。上述方法中，所述α－酮戊二酸脱氢酶基因（sucA）可编码c1和c2的蛋白质：c1、由SEQIDNo.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c2、在SEQIDNo.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有α－酮戊二酸脱氢酶活性的由c1）衍生的蛋白质；所述乙酰辅酶A合成酶基因（acs）可编码d1和d2的蛋白质：d1、由SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；d2、在SEQIDNo.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有乙酰辅酶A合成酶活性的由d1）衍生的蛋白质；所述丙酮酸氧化酶基因（poxB）可编码e1和e2的蛋白质：e1、由SEQIDNo.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；e2、在SEQIDNo.7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有丙酮酸氧化酶活性的由e1）衍生的蛋白质；所述异柠檬酸裂合酶基因（aceA）可编码f1和f2的蛋白质：f1、由SEQIDNo.9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；f2、在SEQIDNo.9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有异柠檬酸裂合酶活性的由f1）衍生的蛋白质；所述β－内酰胺酶基因（ampC）可编码g1和g2的蛋白质：本文档来自技高网...

【技术保护点】
产头孢菌素G的重组菌的构建方法，包括将扩环酶基因导入受体菌得到产头孢菌素G的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌。

【技术特征摘要】
1.产头孢菌素G的重组菌的构建方法，包括将扩环酶基因导入受体菌得到产头孢菌素G的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌；所述突变型大肠杆菌为下述A1至A8中的任一种：A1、所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行下述a1-a4的改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；a1、将α－酮戊二酸脱氢酶基因敲除；a2、将异柠檬酸裂合酶基因敲除；a3、将β－内酰胺酶基因敲除；a4、用乙酰辅酶A合成酶基因替换丙酮酸氧化酶基因；A2、所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1、所述a3和所述a4改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；A3、所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1和所述a3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；A4、所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1、所述a2和所述a3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；A5、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1和所述a4改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；A6、所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1、所述a2和所述a4改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；A7、所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；A8、所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1和所述a2改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述扩环酶基因编码b1和b2的蛋白质：b1、由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b2、在SEQIDNo.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶活性的由b1)衍生的蛋白质。3.根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于：所述α－酮戊二酸脱氢酶基因编码c1和c2的蛋白质：c1、由SEQIDNo.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c2、在SEQIDNo.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有α－酮戊二酸脱氢酶活性的由c1)衍生的蛋白质；所述乙酰辅酶A合成酶基因编码d1和d2的蛋白质：d1、由SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；d2、在SEQIDNo.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有乙酰辅酶A合成酶活性的由d1)衍生的蛋白质；所述丙酮酸氧化酶基因编码e1和e2的蛋白质：e1、由SEQIDNo.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；e2、在SEQIDNo.7所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：林白雪，赵健，杨克迁，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11