一种固定化头孢菌素C酰化酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种固定化头孢菌素C酰化酶及其制备方法。所述固定化头孢菌素C酰化酶包括ES-1树脂和固定于ES-1树脂上的头孢菌素C酰化酶。所述制备方法包括下述步骤：将ES-1树脂和头孢菌素C酰化酶溶于0.5-1.0mol/L，pH 7.0-10.5的磷酸盐缓冲液中，15-35℃固定化8-20h。本发明专利技术提供了一种与现有技术相比固定化时间短、酶活回收率高的固定化头孢菌素C酰化酶的方法，解决了现有技术高生产成本的问题，更适用于工业生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及固定化酶领域，具体涉及一种固定化头孢菌素C酰化酶及其制备方法。
技术介绍
头孢菌素C酰化酶是一类N端亲核(N-terminal nucleophilic，Ntn)水解酶，可直接催化头孢菌素C(cephalosporin C，CPC)生成7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)，而7-ACA又是医药工业生产半合成头孢菌素的重要中间体，需求量很大。因此该酶的固定化在工业上具有广阔的应用前景。目前已报道的固定化头孢菌素C酰化酶，主要采用共价法，如参考文献Characteristic of immobilized cephalosporin C acylase and itsapplication in one-step enzymatic conversion of cephalosporin C to 7-aminocephalosporanic acid.Xiangwei Zhu,Hui Luo,Yanhong Chang,Houbo Su,Qiang Li,Huimin Yu,Zhongyao Shen,World Journal of Microbiology and Biotechnology April 2011Vol 27,Issue 4,pp823-829中选用三种不同的环氧树脂，比较它们的固定化效果，筛选出了一个较好的载体；参考文献Immobilization and thermostability characterization of cephalosporin C acylase.Kai Hua Han,Hui Luo,Yao Zhen Xie,Shun Yao,Yan Hong Chang,Hui Min Yu,Qiang Li,Zhong Yao Shen,Advanced Materials Research Jan 2013Volumes 634-638,p682-688中选用5种不同的环氧树脂，比较它们的固定化效果，并对其中的一个载体进行了固定化条件的优化；中国专利申请(CN103343117A)中也报道了在醋酸钠缓冲液中用不同的载体对头孢菌素C酰化酶进行固定化的效果。上述方法存在如下缺点：所需的固定化时间均在20小时或更长。这在
工业上会增加生产成本，不利于大批量的商品化生产。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题：针对现有头孢菌素C酰化酶固定化技术中的固定化时间较长、均在20小时或更长，增加了生产成本的问题，本专利技术提供了一种新的固定化头孢菌素C酰化酶及其制备方法。该方法与现有技术相比，具有固定化用时大大缩短，且在相同条件下得到的固定化酶具有更高的酶活性、稳定性和重复利用性，克服了现有文献的缺点，解决了现有技术中存在的因用时过长造成的成本增加问题，更适用于工业生产。本专利技术技术方案之一：一种制备固定化头孢菌素C酰化酶的方法，其包括下述步骤：将ES-1树脂和头孢菌素C酰化酶在0.5-1.0mol/L，pH 7.0-10.5的磷酸盐缓冲液中混合，15-35℃固定化8-20h，得固定化头孢菌素C酰化酶。本专利技术较佳地还可以包括下述步骤：将得到的固定化头孢菌素C酰化酶用0.01-0.1mol/L磷酸盐缓冲液或水洗涤，较佳地洗涤3-5次，以除去表面未结合的蛋白。本专利技术较佳地还可以包括固定化头孢菌素C酰化酶的活性检测方法。所述检测方法为：将收集的固定化头孢菌素C酰化酶加入含有头孢菌素C的PBS缓冲液中反应，检测7-ACA的生成量，计算它的表观酶活回收率。本专利技术中，所述ES-1树脂为本领域常规，购自天津南开和成科技有限公司，所述ES-1树脂也被称为ESS-1树脂或ES-V-1树脂，为一种负载有环氧基团的载体。较佳地，所述ES-1树脂为预处理后的ES-1树脂。所述预处理包括下述步骤：所述ES-1树脂在0.01-0.1mol/L pH8.0-8.5的磷酸盐缓冲液中，20-30℃静置15-30min，得预处理后的ES-1树脂。所得的预处理后的ES-1树脂较佳地还可以洗涤、抽干，所述洗涤的次数为本领域常规，较佳地为3～5次，所述抽干为本领域常规，较佳地为使用真空泵抽干。所述预处理后的ES-1较佳地于4℃保存备用。本专利技术中，所述头孢菌素C酰化酶为本领域常规，包括野生型头孢菌素
C酰化酶或者具有头孢菌素C酰化酶活性的突变体。所述头孢菌素C酰化酶的制备方法为本领域常规，较佳地为通过含有头孢菌素C酰化酶基因重组载体的转化体表达纯化制得，更佳地为通过含有表达头孢菌素C酰化酶的pET28a(+)重组载体的E.coli BL21(DE3)菌株表达纯化制得。本专利技术中，所述头孢菌素C酰化酶与ES-1树脂加入的比例较佳地为150-280U/g，更佳为200U/g。所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.5-1.0mol/L，较佳地为0.7-1.0mol/L，更佳地为0.9-1.0mol/L，最佳地为1.0mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0-10.5，较佳地为8.5-10.5，更佳地为9.0-10.0，最佳地为9.5。所述固定化为本领域常规，较佳地为震荡或搅拌固定化。所述震荡为本领域常规，较佳地为通过旋转固定化，更佳地为用摇床旋转。所述旋转的转速为本领域常规，较佳地为120-180r/min，更佳地为120-150r/min，最佳地为150r/min。所述固定化的温度为15-35℃，较佳地为15-25℃，更佳地为25℃，所述固定化的时间为8-20h，较佳地为8-12h，更佳地为10-12h，最佳地为12h。本专利技术中，较佳地还可以包括下述步骤：将得到的固定化酶用0.01-0.1mol/L的磷酸盐缓冲液或水洗涤，以除去表面未结合的蛋白。所述洗涤为本领域常规，较佳地为洗涤3～5次。所得洗涤后的固定化酶较佳地还可以抽滤，所述抽滤为本领域常规，较佳地为使用真空泵抽滤。所得的抽滤后的固定化酶较佳地保存在4℃备用。所述磷酸盐缓冲液为本领域常规，较佳地为磷酸钠缓冲液。所述磷酸盐缓冲液pH值为本领域常规，较佳地为8.0-8.5。本专利技术中，固定化头孢菌素C酰化酶的活性检测方法为：将收集的固定化酶加入含有头孢菌素C的PBS缓冲液中反应，检测7-ACA的生成量，计算表观酶活回收率。所述PBS缓冲液的浓度为本领域常规，较佳地为0.1mol/L。所述PBS缓冲液中头孢菌素C的含量为本领域常规，较佳地为5mg/ml。所述反应的时间为本领域常规，较佳地为15min。所述检测7-ACA的生成量的方法为本领域常规，较佳地为HPLC。本专利技术技术方案之二：一种固定化头孢菌素C酰化酶，其包括ES-1
树脂和固定于ES-1树脂上的头孢菌素C酰化酶。较佳地，所述头孢菌素C酰化酶通过氨基酸残基与ES-1树脂上的环氧基团形成共价键；所述固定于ES-1树脂上的头孢菌素C酰化酶的表观酶活为75-120U/g。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术针对现有固定化头孢菌素C酰化酶的技术中的固定化时间长，酶活性回收率低的问题，提供了一种固定化时间缩短至1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备固定化头孢菌素C酰化酶的方法，其特征在于，其包括下述步骤：将ES‑1树脂和头孢菌素C酰化酶在0.5‑1.0mol/L，pH 7.0‑10.5的磷酸盐缓冲液中混合，15‑35℃固定化8‑20小时，得固定化头孢菌素C酰化酶。

【技术特征摘要】
1.一种制备固定化头孢菌素C酰化酶的方法，其特征在于，其包括下述步骤：将ES-1树脂和头孢菌素C酰化酶在0.5-1.0mol/L，pH 7.0-10.5的磷酸盐缓冲液中混合，15-35℃固定化8-20小时，得固定化头孢菌素C酰化酶。2.如权利要求1所述制备固定化头孢菌素C酰化酶的方法，其特征在于，所述ES-1树脂为预处理后的ES-1树脂；和/或，所述预处理包括下述步骤：所述ES-1树脂在0.01-0.1mol/L pH8.0-8.5的磷酸盐缓冲液中，于20-30℃放置15-30分钟。3.如权利要求1所述制备固定化头孢菌素C酰化酶的方法，其特征在于，其还包括下述步骤：将所得固定化头孢菌素C酰化酶用0.01-0.1mol/L磷酸盐缓冲液或水洗涤。4.如权利要求1所述制备固定化头孢菌素C酰化酶的方法，其特征在于，所述头孢菌素C酰化酶与所述ES-1树脂的比例为150-280U/克。5.如权利要求1所述制备固定化头孢菌素C酰化酶的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.7...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡又佳，张伟，徐雪丽，谢丽萍，刘艳，龚桂花，刘海元，
申请(专利权)人：中国医药工业研究总院，上海欣生源药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31