一种羰基还原酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种羰基还原酶突变体及其应用。本发明专利技术的羰基还原酶突变体的突变位点包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第88位、第142位、第190位和第193位。本发明专利技术的羰基还原酶突变体相对于野生型羰基还原酶具有更高的酶活性。其中部分羰基还原酶突变体的酶活性是野生型羰基的50倍。本发明专利技术的羰基还原酶突变体在液态反应体系中，在辅酶存在下，能使如式I所示化合物进行如下式所示的还原反应，并以转化率>99％，手性ee值>99％，手性de值>99％制备得到如式

【技术实现步骤摘要】
一种羰基还原酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物催化合成领域，涉及一种羰基还原酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]含有手性氨基醇类结构的化合物具有多样的生物活性，被广泛应用于医药化工领域，如用于治疗帕金森病和低血压症的屈西多巴，具有广谱的抗菌活性的氯霉素，兽药氟苯尼考和甲砜霉素，口服戈谢病治疗药物依利格鲁司他和其他具有抗炎抗感染抗肿瘤等活性的临床候选药物。其中，1949年上市的氯霉素作为广谱抗生素，全球的产量主要集中在中国，国内生产规模约在3000吨。但随着环保标准的不断提高以及处理三废(废水、废气、废固)成本越来越高，现有的生产工艺已经难以满足发展的要求。因此迫切需要一条更加绿色经济环保的工艺路线，去解决现有生产工艺存在的环保问题。本实验室中国专利申请公开文本CN111808893A中使用羰基还原酶介导的动态动力学拆分还原的生物催化方法，能够有效解决氯霉素现有生产工艺中存在的高污染、高能耗、低效率、低质量等问题。因此工业界迫切需要一个更加高效且稳定的羰基还原酶，用于合成氯霉素和其他手性氨基醇类药物。
[0003]
技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中羰基还原酶突变体的活性较低的缺陷，提供一种羰基还原酶突变体及其应用。本专利技术的羰基还原酶突变体相对于野生型羰基还原酶具有更高的酶活性，可用于催化如式Ⅰ所示化合物发生羰基还原反应
[0005]本专利技术提供了一种羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体的突变位点包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第88位、第142位、第190位和第193位。
[0006]本专利技术中，较佳地，所述羰基还原酶突变体的突变位点还包括选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第121位、第138位、第192位、第201位、第204位、第206位和第207位中的一位或多位。
[0007]本专利技术中，更佳地，所述羰基还原酶突变体的突变位点还包括还选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第121位、第138位、第192位、第201位、第204位、第206位和第207位中的至少3位。
[0008]本专利技术中，较佳地，所述羰基还原酶突变体的突变位点，所述羰基还原酶突变体的突变位点选自以下任一组：
[0009](1)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位和第193位；
[0010](2)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位和第201位；
[0011](3)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第204位和第206位；
[0012](4)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第206位和第207；
[0013](5)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第201位、第206位和第207位；
[0014](6)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第192位、第193位、第204位和第206位；
[0015](7)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第201位和第204位。
[0016]本专利技术中，较佳地，所述第82位的氨基酸残基由W突变为L。
[0017]本专利技术中，较佳地，所述第88位的氨基酸残基由F突变为V、I或S，例如I或V。
[0018]本专利技术中，较佳地，所述第121位的氨基酸残基由V突变为A。
[0019]本专利技术中，较佳地，所述第138位的氨基酸残基由A突变为V或L，例如L。
[0020]本专利技术中，较佳地，所述第142位的氨基酸残基由R突变为M、F、H或L，例如M。
[0021]本专利技术中，较佳地，所述第190位的氨基酸残基由A突变为V。
[0022]本专利技术中，较佳地，所述第192位的氨基酸残基由R突变为M。
[0023]本专利技术中，较佳地，所述第193位的氨基酸残基由S突变为A。
[0024]本专利技术中，较佳地，所述第201位的氨基酸残基由Y突变为F。
[0025]本专利技术中，较佳地，所述第204位的氨基酸残基由N突变为A或G，例如A。本专利技术中，较佳地，所述第206位的氨基酸残基由K突变为H。
[0026]本专利技术中，较佳地，所述第207位的氨基酸残基由K突变为N。
[0027]本专利技术中，所述羰基还原酶突变体的突变位点和种类如下表1所示：
[0028]表1
[0029][0030][0031]本专利技术还提供一种如式II所示化合物的制备方法，其包括如下步骤：在液态反应体系中，如式I所示化合物在辅酶和前述羰基还原酶突变体存在下，进行如下式所示的还原
反应即可；
[0032][0033]R1为H、或苄基；
[0034]R1‑1为C1‑
C6烷基或苄基；
[0035]R2为H、或苄基；
[0036]R2‑1为C1‑
C6烷基或苄基；
[0037]R3为其中R3‑1为C1‑
C6烷基；
[0038]R4为H、NO2、卤素、C1‑
C6烷基、C1‑
C6烷氧基或C1‑
C6烷基取代的磺酰基。
[0039]本专利技术中，较佳地，所述卤素为F、Cl、Br或I。
[0040]本专利技术中，较佳地，所述C1‑
C6烷基为C1‑
C4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基。
[0041]本专利技术中，较佳地，R1为H、为H、
[0042]本专利技术中，较佳地，R2为H、为H、
[0043]本专利技术中，较佳地，R4为H、NO2、F、Cl、Br、I、甲基、甲氧基或
[0044]本专利技术中，较佳地，R3为
[0045]本专利技术中，更佳地，R1为H、R2为R3为R4为F、Cl或Br。
[0046]本专利技术中，较佳地，所述如式I所示化合物为所述如式I所示化合物为
[0047]本专利技术中，较佳地，所述如式II所示化合物为所述如式II所示化合物为
[0048]本专利技术中，所述辅酶可为本领域常规的辅酶，较佳地，所述辅酶为还原性辅本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的突变位点包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第88位、第142位、第190位和第193位。2.如权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的突变位点还包括选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第121位、第138位、第192位、第201位、第204位、第206位和第207位中的一个或多个；较佳地，所述羰基还原酶突变体的突变位点还包括还选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第121位、第138位、第192位、第201位、第204位、第206位和第207位中的至少3个。3.如权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的突变位点选自以下任一组：(1)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位和第193位；(2)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位和第201位；(3)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第204位和第206位；(4)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第206位和第207；(5)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第201位、第206位和第207位；(6)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第192位、第193位、第204位和第206位；(7)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第201位和第204位。4.如权利要求2或3所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体包括以下突变中的一种或多种：
①
所述第82位的氨基酸残基由W突变为L；
②
所述第142位的氨基酸残基由R突变为M、F、H或L，例如M；
③
所述第190位的氨基酸残基由A突变为V；和
④
所述第193位的氨基酸残基由S突变为A；较佳地，所述羰基还原酶突变体还包括以下突变中的一种或多种：
①
所述第88位的氨基酸残基由F突变为V、I或S，例如I或V；
②
所述第121位的氨基酸残基由V突变为A；
③
所述第138位的氨基酸残基由A突变为V或L，例如L；
④
所述第192位的氨基酸残基由R突变为M；
⑤
所述第201位的氨基酸残基由Y突变为F；
⑥
所述第204位的氨基酸残基由N突变为A或G，例如A；
⑦
所述第206位的氨基酸残基由K突变为H；和
⑧
所述第207位的氨基酸残基由K突变为N。
5.如权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的突变位点和种类如下表所示：位点和种类如下表所示：
6.一种如式II所示化合物的制备方法，其包括如下步骤：在液态反应体系中，如式I所示化合物在辅酶和如权利要求1
‑
5中任一项所述的羰基还原酶突变体存在下，进行如下式所示的还原反应即可；R1为H、或苄基；R1‑1为C1‑
C6烷基或苄基；R2为H、或苄基；R2‑1为C1‑
C6烷基或苄基；R3为其中R3‑1为C1‑
C6烷基；R4为H、NO2、卤素、C1‑
C6烷基、C1‑
C6烷氧基或C1‑
C6烷基取代的磺酰基。7.如权利要求6所述的如式II所示化合物的制备方法，其特征在于，所述的还原反应满足下述条件中的一种或多种：
①
所述卤素为F、Cl、Br或I；
②
所述C1‑
C6烷基为C1‑
C4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈少欣，张福利，汤佳伟，倪国伟，张露文，柳箫，余俊，
申请(专利权)人：中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：