7α-羟基类固醇脱氢酶末端改造组合点突变及高效合成熊去氧胆酸中间体制造技术

本发明专利技术公开了7α

【技术实现步骤摘要】
7
α
‑
羟基类固醇脱氢酶末端改造组合点突变及高效合成熊去氧胆酸中间体


[0001]本专利技术涉及7α
‑
羟基类固醇脱氢酶末端改造组合点突变及高效合成熊去氧胆酸中间体，属于基因工程和生物催化


技术介绍

[0002]鹅去氧胆酸(又名3α,7α
‑
二羟基
‑5‑
β
‑
胆烷酸)是一种含有2个羟基的类固醇，主要作用是降低胆汁内胆固醇的饱和度。7
‑
氧代
‑
石胆酸(又名3α
‑
羟基
‑7‑
氧代
‑
5β
‑
胆烷酸)是鹅去氧胆酸的还原产物，充当熊去氧胆酸(又名3α,7β
‑
二羟基
‑
5β
‑
胆甾烷
‑
24
‑
酸)合成的中间体。熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸互为立体异构体，主要作用是治疗治疗胆结石、脂肪肝、胆汁性消化不良和预防新冠病毒等。
[0003]7α
‑
羟基类固醇脱氢酶(7α
‑
HSDH，EC 1.1.1.159)是用于生产7
‑
氧代
‑
石胆酸的主要酶之一。7α
‑
HSDH属于短链脱氢酶/还原酶。天然的7α
‑
HSDH酶在催化合成7
‑
氧代
‑
石胆酸生产中效率低，酶的热稳定性较差。近年来，计算机辅助蛋白设计策略在提高蛋白催化效率、立体/区域选择性、稳定性方面做出了巨大的贡献。如通过结构指导的定点突变提高了亚胺还原酶对(R)
‑3‑
苄基氨基
‑1‑
Boc
‑
哌啶的合成效率，催化效率比野生型提高了4193倍，T
m
提高16.2℃，产物光学纯度从78％提高到99％。基于结构信息定点诱变的活性位点替换，Eiben等人为了增加CYP102A1的过程稳定性，将CYP102A1不稳定的还原酶结构域与稳定的CYP102A3结构域交换，获得了稳定性增强的嵌合融合蛋白，在50℃时半衰期为100分钟，比野生型CYP102A1提高10倍以上。热稳定性好的蛋白质通常具有更高的刚性，而柔性区域，如柔性残基、蛋白质链的N端和C端loop，与其它氨基酸的接触次数很少。因此截短、替换柔性环或引入点突变以增强柔性残基的刚性是提高稳定性的有效方法。Savino等人基于结构比对，分段截短了C.absonum 7β
‑
HSDH的C末端片段，活性降低1000倍甚至失活。娄等人提出了C.absonum 7α
‑
HSDH中的loop结构(残基194
–
211)与酶的热稳定性密切相关。
[0004]专利技术人筛选到一种来自Brucella melitensis的7α
‑
HSDH，能够以鹅去氧胆酸为底物，以NAD
+
为辅酶，在碱性条件下稳定催化合成7
‑
氧代
‑
石胆酸。但是野生型酶催化稳定性和催化效率较低，导致生物制备过程中时间成本和经济成本较高，阻碍其工业化进程。本专利技术通过计算机辅助蛋白设计策略来研究末端修饰对蛋白表达、催化效率和热稳定性的影响。首先基于同源建模获得7α
‑
HSDH的三维结构，结合蛋白功能的先验信息进行分子对接、动力学模拟分析蛋白末端的柔性变化。基于序列、结构特征，loop N无序区域进行分段截短，结合单点突变进行定向组合突变，并考察突变体对酶的表达、催化效率和热稳定性的影响。获得了酶催化效率与热稳定性显著提高的突变体，对于工业化制备7
‑
氧代
‑
石胆酸具有重要的研究意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术人团队发现来自B.melitensis的7α
‑
HSDH，能够以鹅去氧胆酸为底物，催化
合成7
‑
氧代
‑
石胆酸，但是野生型酶稳定性和催化效率较低，导致生物制备过程中催化周期长，转化效率低。
[0006]本专利技术将来源于布鲁氏菌(B.melitensis)的7α
‑
HSDH基因根据大肠杆菌密码子的偏好性进行密码子优化后，进行基因的化学合成。然后通过N
‑
末端不同长度氨基酸截短和/或对酶底物结合口袋区域特定的氨基酸突变的组合，获得了催化效率与热稳定性明显提高的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体，实现了7
‑
氧代
‑
石胆酸的高效合成。
[0007]本专利技术的来源于B.melitensis的7α
‑
HSDH基因含有915bp碱基，本专利技术提供了针对大肠杆菌密码子偏好性进行优化得到的7α
‑
HSDH基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示基因编码的7α
‑
HSDH包含有305个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术提供了一种7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体，所述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短得到的；或，所述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第196位、第258位，第262位的一个或多个氨基酸进行突变得到的。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体为以下(a)～(f)任一：
[0010](a)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短得到的，命名为：ΔN53；
[0011](b)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第196位甲硫氨酸突变为异亮氨酸得到的，命名为：ΔN53/M196I；
[0012](c)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第258位异亮氨酸突变为甲硫氨酸得到的，命名为：ΔN53/I258M；
[0013](d)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为：ΔN53/K262T；
[0014](e)将氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短得到的；或，所述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第196位、第258位，第262位的一个或多个氨基酸进行突变得到的。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体为以下(a)～(f)任一：(a)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
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羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短得到的；(b)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第196位甲硫氨酸突变为异亮氨酸得到的；(c)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第258位异亮氨酸突变为甲硫氨酸得到的；(d)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的；(e)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的1～53位氨基酸进行截短，同时将第258位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的；(f)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α
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羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的1～53位氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：张荣珍，柳志永，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：