高效生产(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的融合酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶包括依次连接的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列和羰基还原酶的氨基酸序列。本发明专利技术构建含羰基还原酶CpCR和含葡糖糖脱氢酶GDH的融合酶应用于催化还原OPBE；葡萄糖脱氢酶的表达提高了NADPH的再生效率，为生物催化反应提供了充足的NADPH，该辅酶NADPH再生系统的应用避免了生物催化反应中额外添加昂贵的辅酶。且该羰基还原酶CpCR具有广泛的底物谱和优良的光学选择性。择性。

【技术实现步骤摘要】
高效生产(R)
‑2‑
羟基
‑4‑
苯基丁酸乙酯的融合酶及其应用
一、

[0001]本专利技术属于不对称合成
，涉及一种高效生产(R)
‑2‑
羟基
‑4‑
苯基丁酸乙酯重组菌的构建及其在手性醇合成中的应用。
[0002]二、背景领域
[0003](R)
‑2‑
羟基
‑4‑
苯基丁酸乙酯(Ethyl(R)
‑2‑
hydroxy
‑4‑
phenylbutyrate，R
‑
HPBE)，CAS号90315
‑
82
‑
5，分子式C
12
H
16
O3，分子量208.25，密度为1.075g/mL，沸点为212℃，不溶于水，易溶于有机溶剂。(R)
‑
HPBE是合成血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的重要前体，用于合成依那普利、贝那普利、利辛普利等抗高血压和充血性心力衰竭药物，常用于治疗充血性心力衰竭和高血压。到目前为止，已经开发了一系列制备(R)
‑
HPBE的方法，包括化学多步合成、外消旋体的动力学拆分和2
‑
羟基
‑4‑
苯基丁酸的酶法酯化等。由于(R)
‑
HPBE是生产普利类药物的重要中间体，故R
‑
HPBE的制备方法在国内外引起众多关注，其中不对称还原2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸乙酯(OPBE)的途径因其产量高、反应条件温和、绿色环保、经济可行等优点而备受关注，以期获得一条经济、原子利用率高的绿色合成工艺。
[0004]近年来，利用微生物细胞生物催化制备手性醇越来越多的关注，微生物细胞(含有羰基还原酶)作为一种高选择性的催化潜手性羰基化合物合成手性醇的生物催化剂，在制备手性化合物领域中已取得了一定成就。但绝大对数氧化还原酶是复合型酶，在催化反应过程中需要添加辅酶NADH或NADPH，反应才能顺利进行。在不对称还原潜手性羰基化合物的生物反应过程中，需要消耗大量的NADPH来参与为其传递电子，如辅酶被消耗彻底，反应将会停止。虽然在细胞生长过程中会有少量的还原性辅酶参与自身代谢，但无法达到不对称还原反应的生产需求。辅酶NADPH由于的价格昂贵，额外添加辅酶不适于工业化生产，并且辅酶的稳定性差；因此需要建立高效、经济的辅酶再生体系以适应工业化、大批量生产。
[0005]本专利技术构建了含有羰基还原酶CpCR基因的重组菌，同时引入葡萄糖脱氢酶GDH基因，利用该重组菌催化还原OPBE，高效、高立体选择性(e.e.>99％)地生成(R)
‑
HPBE。与传统的化学方法相比，该方法具有反应条件温和、反应收率高、成本低等优点。
三、
技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种高效生产(R)
‑
HPBE的重组酶的构建方法及其应用。包括构建重组羰基还原酶质粒，同时引入葡萄糖脱氢酶基因，构建了一株具有高选择性的重组菌，并利用该重组菌所产生的酶作为生物催化剂催化潜手性羰基化合物OPBE不对称还原合成手性醇(R)
‑
HPBE。进一步研究一系列反应因素(助溶剂、温度、pH、离子种类等)对不对称还原反应的影响。
[0007]本专利技术采用的技术方案是：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶包括依次连接的如SEQ ID NO:2所示葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列和如SEQ ID NO:1所示羰基还原酶的氨基酸序列。
[0009]SEQ ID NO:1(Candida parapsilosis，近平滑假丝酵母)
[0010]MTKAVPDKFQGFAVSDPKNWNRPKLASYERKQINPHDVVLKNEVCGLCYSDIHTLSAGWQPLQRDNLVVGHEIIGEVIAVGDEVTEFKVGDRVGIGAASSSCRSCQRCDSDNEQYCKQGAATYNSKDVRSNNYVTQGGYSSHSIADEKFVFAIPEDLPSSYGAPLMCAGITVFSPLIRNLGLDARGKNVGIIGIGGLGHLALQFANAMGANVTAFSRSSSKKEQAMKLGAHDFVATGEDKTWYKNYDDHFDFILNCASGIDGLNLSEYLSTLKVDKKFVSVGLPPSEDKFEVSPFTFLQQGASFGSSLLGSKTEVKEMLNLAAKHNVRPMIEEVPISEENCAKALDRCHAGDVRYRFVFTDFDKAFKA
[0011]SEQ ID NO:2(Bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌，Gene ID为AAA22463.1)
[0012]MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHAFPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGRG
[0013]优选地，所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0014]SEQ ID NO:3
[0015]MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAV
[0016]VVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGA
[0017]FLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHAFPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGI
[0018]RVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTG
[0019]ITLFADGGMTQYPSFQAGRGGGGGSGGGGSMTKAVPDKFQGFAVSDPKNWNRPKLASYER
[0020]KQINPHDVVLKNEVCGLCYSDIHTLSAGWQPLQRDNLVVGHEIIGEVIAVGDEVTEFKVG
[0021]DRVGIGAASSSCRSCQRCDSDNEQYCKQGAATYNSKDVRSNNYVTQGGYSSHSIADEKFV
[0022]FAIPEDLPSSYGAPLMCAGITVFSPLIRNLGLDARGKN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，其特征在于：所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶包括依次连接的如SEQ ID NO:2所示葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列和如SEQ ID NO:1所示羰基还原酶的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，其特征在于：所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。3.如权利要求1所述的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的编码基因。4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。5.包含如权利要求3所述的编码基因的重组表达质粒。6.如权利要求5所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒的载体是pETDuet
‑
1。7.包含如权利要求5所述的重组表达质粒的工程菌。8.如权利要求7所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。9.如权利要求1所述的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶在不对称还原2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸乙酯制备(R)
‑2‑
羟基
‑4‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：欧志敏，王金美，卢媛，张楚玥，程朋朋，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：