【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物代谢工程，尤其涉及一种稳定生产l-甲硫氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、甲硫氨酸(l-methionine)，是生物体唯一含硫的必需氨基酸，又名蛋氨酸或2-氨基-4-甲硫基丁酸((s)-2amino-4-(methylthio)butanoic acid)。s-腺苷甲硫氨酸(sam)是合成dna、rna等生物大分子和补充剂或治疗性药物的主要生物甲基供体，l-甲硫氨酸可作为sam的前体间接参与多种代谢过程，在动物饲料、人体营养以及化妆品等方面具有商业价值。其合成方法主要包括化学合成法，酶催化法以及微生物发酵法。近年来，化学合成法合成l-甲硫氨酸的技术成熟且成本低，但是其步骤繁琐，常带来环境污染等问题；酶催化法具有较强的专一性和立体选择性，反应简单，但其原料价格偏高，并不适用于大规模生产；微生物发酵法绿色高效低污染，反应条件温和，使得其受到研究者的广泛关注。
2、目前，有较多学者已经对l-甲硫氨酸在谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)和大肠杆菌(escherichia coli)中的合成途径及机制进行了深入研究，并将代谢工程策略和合成生物学手段应用于l-甲硫氨酸高产菌株的构建中。这些策略大致可分为以下几种：(1)解除代谢途径中关键酶的反馈调节，如移除转录负调控基因、定点突变天冬氨酸激酶解除赖氨酸及苏氨酸对其的反馈抑制、解除终产物l-甲硫氨酸及sam的反馈抑制、增加高丝氨酸o-琥珀酰转移酶活性等；(2)削弱竞争与降解途径，使其更多流向l-甲硫氨酸的合成，如
3、但在上述策略中，由于微生物中l-甲硫氨酸的生物合成途径较为复杂，受到多层次的调控，生长与生产之间的关系难以协调，因此目前仍无法理性实现过程最优化调控。另外，在发酵过程中，质粒丢失、诱导剂以及抗生素的添加也会带来了相应一系列问题，如产量不稳定、生产成本提高等问题，这些阻碍了利用微生物发酵法的工业化生产l-甲硫氨酸。
技术实现思路
1、为了解决上述微生物发酵法合成l-甲硫氨酸技术问题，本专利技术提供了一种稳定生产l-甲硫氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本专利技术通过平衡生长与生产，在大肠杆菌中引入外源的从高丝氨酸到高半胱氨酸的途径以增加l-甲硫氨酸的生成，并在质粒不同位置引入毒素-抗毒素系统hok/sok，使转化质粒后形成的重组菌株在无抗生素添加的情况下实现l-甲硫氨酸的稳定生产。
2、本专利技术的具体技术方案为：
3、第一方面，本专利技术提供了一种稳定生产l-甲硫氨酸的基因工程菌。具体地，所述基因工程菌通过在底盘菌基因组上对thrb基因进行敲降、再过表达suca基因和metz*基因、并引入毒素-抗毒素系统hok/sok获得。
4、本专利技术基因工程菌能稳定生产l-甲硫氨酸的原理在于：
5、①通过对thrb基因进行敲降削弱苏氨酸分支途径，以此减少高丝氨酸的消耗并同时保持菌体生长不受影响。将thrb基因实现减少表达，有利于平衡菌株的生长与l-甲硫氨酸的生产，若将thrb基因完全敲除，不利于菌株的生长，因而不能完全敲除；但若将thrb基因正常表达，不利于l-甲硫氨酸的生产。
6、②本专利技术通过过表达三羧酸循环中suca基因增强琥珀酰辅酶a的供应，并引入外源o-琥珀酰巯基转移酶突变体metz*基因，增加高丝氨酸至高半胱氨酸途径，平衡生长与生产，从而提高l-甲硫氨酸的生成量。
7、③引入毒素-抗毒素系统hok/sok，使得菌株可在无抗生素添加的情况下保持质粒的稳定，避免抗生素的添加产生的质粒丢失的问题，同时，o-琥珀酰巯基转移酶突变体metz*基因可以在不添加抗生素的毒素-抗毒素系统hok/sok表达下，实现高丝氨酸至高半胱氨酸途径的稳定增加。
8、基于上述原理，本专利技术通过在底盘菌基因组上对thrb基因进行敲降、再过表达suca基因和metz*基因、并引入毒素-抗毒素系统hok/sok获得一种稳定生产l-甲硫氨酸的基因工程菌。
9、作为本专利技术上述技术方案的优选，底盘菌为e.coli w3110δmetjδmetiδlysatrc-meth trc-metf trc-cyse trc-serb trc-serc/pa*ham。
10、作为本专利技术上述技术方案的优选，敲降后底盘菌基因组的thrb基因核苷酸序列如seq id no.1所示，suca基因核苷酸序列如seq id no.2所示，毒素-抗毒素系统hok/sok的核苷酸序列如seq id no.4所示。
11、作为本专利技术上述技术方案的优选，metz*基因编码的氨基酸序列为源于chromobacterium violaceum的metz基因编码的氨基酸序列进行以下位点的突变得到的氨基酸序列：
12、(a)第306位谷氨酰胺突变为丙氨酸；
13、(b)第311位丙氨酸突变为甘氨酸；
14、(c)第365位精氨酸突变为丙氨酸。
15、metz基因编码的氨基酸序列经过上述位点的突变后，其编码得到的o-琥珀酰巯基转移酶突变体可以在外源导入底盘菌后，得到稳定高效表达，同时，可以在不添加抗生素的毒素-抗毒素系统hok/sok表达下，实现高丝氨酸至高半胱氨酸途径的稳定增加。
16、进一步优选，metz*基因核苷酸序列如seq id no.3所示。
17、seq id no.3所示的核苷酸序列编码的o-琥珀酰巯基转移酶突变体可以在外源导入底盘菌后，得到稳定高效表达，同时，可以在不添加抗生素的毒素-抗毒素系统hok/sok表达下，实现高丝氨酸至高半胱氨酸途径的稳定增加。
18、第二方面，本专利技术提供了上述稳定生产的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
19、(1)在底盘菌基因组上敲降thrb基因；
20、(2)在质粒上过表达来自e.coli w3110的suca基因，并转化至底盘菌中；
21、(3)在质粒上过表达来自chromobacterium violaceum的metz基因，并将其突变，然后转化至底盘菌中；
22、(4)在质粒上引入毒素-抗毒素系统hok/本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种稳定生产L-甲硫氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌通过在底盘菌基因组上对thrB基因进行敲降、再过表达sucA基因和metZ*基因、并引入毒素-抗毒素系统hok/sok获得。
2.如权利要求1所述的一种稳定生产L-甲硫氨酸的基因工程菌，其特征在于：底盘菌为E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC/pA*Ham。
3.如权利要求1所述的一种稳定生产L-甲硫氨酸的基因工程菌，其特征在于：敲降后底盘菌基因组的thrB基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，sucA基因核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，毒素-抗毒素系统hok/sok的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
4.如权利要求1所述的一种稳定生产L-甲硫氨酸的基因工程菌，其特征在于：metZ*基因编码的氨基酸序列为源于Chromobacterium violaceum的metZ基因编码的氨基酸序列进行以下位点的突变得到的氨基酸序列：
5.如权利要求4
6.如权利要求1～5任一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于：敲降thrB基因的方法为：将thrB基因的起始密码子ATG突变为GTG。
8.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于：metZ基因突变后，其编码的氨基酸序列，相对于metZ基因编码的氨基酸序列进行了以下位点的突变：
9.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于：底盘菌为E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA Trc-metH Trc-metF Trc-cysE Trc-serB Trc-serC/pA*Ham；质粒为pAm。
10.如权利要求1～5任一项所述的基因工程菌或如权利要求6～9任一项所述的构建方法构建得到的基因工程菌在生产L-甲硫氨酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种稳定生产l-甲硫氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌通过在底盘菌基因组上对thrb基因进行敲降、再过表达suca基因和metz*基因、并引入毒素-抗毒素系统hok/sok获得。
2.如权利要求1所述的一种稳定生产l-甲硫氨酸的基因工程菌，其特征在于：底盘菌为e.coli w3110δmetjδmetiδlysa trc-meth trc-metf trc-cyse trc-serb trc-serc/pa*ham。
3.如权利要求1所述的一种稳定生产l-甲硫氨酸的基因工程菌，其特征在于：敲降后底盘菌基因组的thrb基因核苷酸序列如seq id no.1所示，suca基因核苷酸序列如seq idno.2所示，毒素-抗毒素系统hok/sok的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4.如权利要求1所述的一种稳定生产l-甲硫氨酸的基因工程菌，其特征在于：metz*基因编码的氨基酸序列为源于chromobacterium violaceum的metz基因编码的氨基酸序列进行以...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，郭盈盈，王丽娟，逄爱萍，牛坤，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。