【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及烯还原酶。
技术介绍
1、δ-癸内酯，即丁位癸内酯，又称δ-正戊基-δ-戊内酯或5-羟基癸酸内酯，具有强烈持久的奶油香特征，是调制牛奶和奶油香精的重要原料，同时也广泛用于调配椰子、草莓、桃等香料，在人造奶油、冰淇淋、软饮料、糖果、焙烤食品及调味料中大量应用，市场需求量非常大。
2、传统的δ-癸内酯生产工艺为化学合成，即用过酸将5-戊基环戊酮氧化制得。由于化学合成途径存在反应条件苛刻、副产物难以去除、产品缺乏自然温和的奶油香味等弊端，有关食品添加剂和药品添加剂的法规严格限制化学合成产品的使用。同时，随着消费者对天然产品需求的上升，从天然材料中获取天然香料或使用微生物转化技术生产天然香料，成为香料工业的重要趋势。而天然原料中的香料成分含量普遍较低，受地域、季节、气候等因素制约较大，使得天然提取途径的成本高昂，实际应用受到很大限制。因此，通过生物转化得到的天然香料具有更高的市场接受度和附加值。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种烯还原酶，以提高现有的烯还原酶的转化效率，提高δ-癸内酯产量。
2、具体地，本专利技术根据大肠杆菌的密码子偏好性对来源于一种念珠菌(candidasake)的野生型烯还原酶的基因(seq id no：1)进行密码子优化，合成seq id no:2，以提高该基因的表达效率；通过基因突变的方法在该基因中引入单点突变或多点突变，使改造之后的烯还原酶具有较高的底物特异性及转化率，在发酵过程中降低发酵液中的其他代谢产
3、在第一个方面，本专利技术提供一种烯还原酶，其是将seq id no:41所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质，该蛋白质相比于未突变的seq id no:41所示的烯还原酶具有提高的底物特异性及转化率。
4、在一些实施方案中，上述烯还原酶中，所述烯还原酶是在seq id no:41所示的氨基酸序列的第80、100、127、176、297、311和/或359位进行氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质；优选地，所述氨基酸残基的取代为s80m、s80e、k100n、k100e、t127l、t127w、t127h、q176r、q176y、f297s、f297d、f297k、k311t、k311l、d359f、d359r或d359s中的一个或多个。
5、在优选的实施方式中，所述烯还原酶的氨基酸序列如seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq idno:29、seq id no:30、seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34、seq idno:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39或seq id no:40所示。
6、在一些实施方案中，上述烯还原酶中，除了在第80、100、127、176、297、311和/或359位发生上述突变之外，其进一步可以在其他位点上具有氨基酸的保守取代，使得突变后的氨基酸比seq id no:41所示的烯还原酶具有更加优异的底物特异性。优选地，所述氨基酸的保守取代保留本专利技术烯还原酶变体的底物特异性。对于本领域的技术人员而言很明显，这种取代可以在上述位点以外的区域发生，而仍保留相应活性。优选地，所述保守取代变体具有至少一个位置的氨基酸保守取代。保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。最常见的氨基酸互换有氨基酸g至a；a至g，s；v至i，l，a，t，s；i至v，l，m；l至i，m，v；m至l，i，v；p至a，s，n；f至y，w，h；y至f，w，h；w至y，f，h；r至k，e，d；k至r，e，d；h至q，n，s；d至n，e，k，r，q；e至q，d，k，r，n；s至t，a；t至s，v，a；c至s，t，a；n至d，q，h，s；q至e，n，h，k，r的互换，以及它们的相反的互换。与上述烯还原酶变体的氨基酸序列具有一定的氨基酸同源性的烯还原酶变体，优选地同源性为70-99％之间，更优选地同源性为80-99％之间，更优选地同源性为90-99％之间，最优选地同源性为99％，也属于本专利技术的保护范围。
7、在第二个方面，本专利技术提供编码上述任一所述的烯还原酶的核酸分子，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
8、在一些实施方案中，上述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：
9、1)具有seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seqid no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seqid no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seqid no:20或seq id no:21所示的核苷酸序列的核酸分子；
10、2)与1)限定的核酸分子杂交且编码上述任一所述的烯还原酶的核酸分子；
11、3)与1)或2)限定的核酸分子具有90％以上的序列同一性且编码上述任一所述的烯还原酶的核酸分子。
12、本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过pcr扩增或人工合成的方法获得。
13、这里使用的术语“同一性”可以用肉眼或计算机软件(比如ausubel et al.eds.(2007)在current protocols in molecular biology中所述的软件程序)进行评价。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同一的。两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。多聚核苷酸序列或氨基酸序列与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基或氨基酸相同。
14、在第三个方面，本专利技术提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子。
15、所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关序列，所述表达载体用于表达相关基因，其中构建表达载体时用到的载体可以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种烯还原酶，为在SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质；
2.一种核酸分子，编码权利要求1所述的烯还原酶；优选地，所述核酸分子为DNA或RNA；
3.一种重组载体，其包含权利要求2所述的核酸分子；优选地，所述重组载体为克隆载体或表达载体。
4.一种重组细胞，其包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的重组载体；优选地，所述重组细胞的宿主细胞为原核生物细胞或真核生物细胞，进一步优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、BL21(DE3)plysS、M15或Top10f’。
5.一种烯还原酶的制备方法，为：
6.根据权利要求5所述的制备方法，包括：将含有权利要求3所述的重组载体导入大肠杆菌，优选BL21(DE3)，得到重组工程菌，然后将该重组工程菌进行诱导表达得到烯还原酶。
7.权利要求1所述的烯还原酶、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的重组细胞或其发酵产物、和/或权利要求
8.一种制备δ-癸内酯的方法，包括使用权利要求1所述的烯还原酶催化底物马索亚内酯，得到δ-癸内酯。
9.根据权利要求8所述的方法，包括发酵权利要求4所述的重组细胞，诱导生成的烯还原酶催化底物马索亚内酯，得到δ-癸内酯。
10.根据权利要求9所述的方法，所述发酵条件为：搅拌、通风使得DO在30％以上，温度为35-42℃，例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃，pH为6.0-7.2；
...【技术特征摘要】
1.一种烯还原酶，为在seq id no:41所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质；
2.一种核酸分子，编码权利要求1所述的烯还原酶；优选地，所述核酸分子为dna或rna；
3.一种重组载体，其包含权利要求2所述的核酸分子；优选地，所述重组载体为克隆载体或表达载体。
4.一种重组细胞，其包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的重组载体；优选地，所述重组细胞的宿主细胞为原核生物细胞或真核生物细胞，进一步优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)、rosetta(de3)、bl21(de3)plyss、m15或top10f’。
5.一种烯还原酶的制备方法，为：
6.根据权利要求5所述的制备方法，包括：将含有权利要求3所述的重组载体导入...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾子樊，王竞辉，吴计划，张德旸，孔令晓，孙烨，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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