【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种高产l-精氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、在微生物生长代谢和调控过程中，l-精氨酸是不可或缺的重要角色。在人体内参与鸟氨酸循环，促进尿素的形成，使人体内产生的氨经鸟氨酸循环转变成无毒的尿素，由尿中排出，从而降低血氨浓度；同事，其有较高浓度的氢离子，可以有助于纠正肝性脑病时的酸碱平衡。l-精氨酸主要用途有：用于生化研究，各类肝昏迷及病毒性肝类谷丙转氨酶异常者；作为营养增补剂、调味剂；与糖进行加热反应(氨基-羰基反应)可获得特殊的香味物质，是gb 2760-2001规定为允许使用的食品用香料；是维持婴幼儿生长发育必不可少的氨基酸；是鸟氨酸循环的中间代谢物，能促使氨转变成为尿素，从而降低血氨含量；是精子蛋白的主要成分，有促进精子生成，提供精子运动能量的作用。此外，静注精氨酸，能刺激垂体释放生长激素，可用于垂体功能试验；在临床上，适用于血氨增高的肝昏迷，特别是伴有碱中毒的患者；用于辅助测定脑垂体功能；口服用于精液分泌不足和精子缺乏引起的男性不育症。精氨酸具有较为广泛的用途。
2、目前，国内外用于l-精氨酸生产的主要方法是蛋白质水解法和发酵法，由于蛋白质水解法生产l-精氨酸含量偏低且纯度不高，在实际生产过程中不仅会产生大量有机废水，对环境危害较大，还会消耗大量的水资源和盐酸等化学物质，增加生产成本，因此，不适于工业化生产。而发酵法由于发酵条件温和，工艺简单，生产成本低，工业化生产方法逐步由水解法向微生物发酵法转变。
3、选育具有l-精氨酸生产能力的高效菌株是微
4、现有技术中，由于微生物中l-精氨酸的生物合成途径较为复杂，受到多层次的调控，生长与生产之间的关系难以协调，因此目前仍无法实现l-精氨酸生产过程的最优化调控。
技术实现思路
1、为了解决上述微生物发酵法合成l-精氨酸技术问题，本专利技术提供了一种高产l-精氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本专利技术通过敲除底盘菌基因组上poxb基因、spec基因、spef基因、ldha基因、adhe基因、prob基因，并在底盘菌基因组中引入ep-bifido途径、插入基因簇argc-argj-argb-argd-argf-argg-argh，调节emp、ppp、以6-磷酸果糖和5-磷酸木酮糖为底物生成乙酰磷酸三条途径中的碳通量，在不影响nadph生成的情况下，提高碳的转化率和减少二氧化碳的释放，最终得到一种高产l-精氨酸的基因工程菌。
2、本专利技术的具体技术方案为：
3、第一方面，本专利技术提供了一种高产l-精氨酸的基因工程菌。具体地，所述基因工程菌通过敲除底盘菌基因组上poxb基因、spec基因、spef基因、ldha基因、adhe基因、prob基因，并在底盘菌基因组中引入ep-bifido途径、插入基因簇argc-argj-argb-argd-argf-argg-argh。
4、本专利技术通过敲除底盘菌基因组上poxb基因、spec基因、spef基因、ldha基因、adhe基因、prob基因，并在底盘菌基因组中引入ep-bifido途径、插入基因簇argc-argj-argb-argd-argf-argg-argh，调节emp、ppp、以6-磷酸果糖和5-磷酸木酮糖为底物生成乙酰磷酸三条途径中的碳通量，在不影响nadph生成的情况下，提高碳的转化率和减少二氧化碳的释放，最终得到一种高产l-精氨酸的基因工程菌，与出发菌株相比，本专利技术提供的基因工程菌l-精氨酸的积累浓度由0提高到7.5g/l，大大提高了l-精氨酸的产量，同时，本专利技术基因工程菌不含质粒，不存在质粒丢失带来的问题。
5、作为本专利技术上述技术方案的优选，基因工程菌基因组中还插入ptrc-argj基因。
6、作为本专利技术上述技术方案的优选，ep-bifido途径的引入方式为：敲除pfka基因、edd基因，并在基因组中整合上fxpk-fbp基因。
7、作为本专利技术上述技术方案的优选，底盘菌为大肠杆菌w3110δlaci。
8、第二方面，本专利技术提供了上述高产l-精氨酸的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
9、(1)敲除底盘菌基因组中的poxb基因，得到重组菌株arg6；
10、(2)敲除重组菌株arg6基因组中的spec基因，得到重组菌株arg7；
11、(3)敲除重组菌株arg7基因组中的spef基因，得到重组菌株arg8；
12、(4)在重组菌株arg8基因组中插入基因簇argc-argj-argb-argd-argf-argg-argh，得到重组菌株arg9；
13、(5)敲除重组菌株arg9基因组中的ldha基因，得到重组菌株arg10；
14、(6)敲除重组菌株arg10基因组中的adhe基因，得到重组菌株arg11；
15、(7)在重组菌株arg11基因组中引入ep-bifido途径，得到所述基因工程菌。
16、作为本专利技术构建方法技术方案的优选，构建方法还包括以下步骤：
17、在底盘菌基因组中插入ptrc-argj基因。
18、进一步优选，在prob位点插入ptrc-argj基因。
19、作为本专利技术构建方法技术方案的优选，ep-bifido途径的引入方式为：敲除pfka基因、edd基因，并在基因组中整合上fxpk-fbp基因。
20、进一步优选，在gapc位点整合上fxpk-fbp基因。
21、第三方面，本专利技术提供了上述基因工程菌在生产l-精氨酸中的应用。
22、与现有技术相比，本专利技术具有以下技术效果：
23、(1)本专利技术通过敲除底盘菌基因组上poxb基因、spec基因、spef基因、ldha基因、adhe基因、prob基因，并在底盘菌基因组中引入ep-bifido途径、插入基因簇argc-argj-argb-argd-argf-argg-argh以及插入ptrc-argj基因，调节emp、ppp、以6-磷酸果糖和5-磷酸木酮糖为底物生成乙酰磷酸三条途径中的碳通量，在不影响nadph生成的情况下，提高碳的转化率和减少二氧化碳的释放，最终得到一种高产l-精氨酸的基因工程菌，与出发菌株相比，本专利技术提供的基因工程菌l-精氨酸的积累浓度由0提高到7.5g/l，大大提高了l-精氨酸的产量。
24、(2)本专利技术提供的基因工程菌生产周期短，不携带质粒，不存在质粒丢失带来的问题，可以稳定高效生产l-精氨酸。
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1.一种高产L-精氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌通过敲除底盘菌基因组上poxB基因、speC基因、speF基因、ldhA基因、adhE基因、proB基因，并在底盘菌基因组中引入EP-bifido途径、插入基因簇argC-argJ-argB-argD-argF-argG-argH。
2.如权利要求1所述的一种高产L-精氨酸的基因工程菌，其特征在于：基因工程菌基因组中还插入Ptrc-argJ基因。
3.如权利要求1所述的一种高产L-精氨酸的基因工程菌，其特征在于：EP-bifido途径的引入方式为：敲除pfkA基因、edd基因，并在基因组中整合上fxpk-fbp基因。
4.如权利要求1所述的一种高产L-精氨酸的基因工程菌，其特征在于：底盘菌为大肠杆菌W3110ΔlacI。
5.如权利要求1～4任一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：还包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：在proB位点插入
8.如权利要求5所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：EP-bifido途径的引入方式为：敲除pfkA基因、edd基因，并在基因组中整合上fxpk-fbp基因。
9.如权利要求8所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：在gapC位点整合上fxpk-fbp基因。
10.如权利要求1～4任一项所述的基因工程菌或如权利要求5～9任一项所述的构建方法构建得到的基因工程菌在生产L-精氨酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高产l-精氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌通过敲除底盘菌基因组上poxb基因、spec基因、spef基因、ldha基因、adhe基因、prob基因，并在底盘菌基因组中引入ep-bifido途径、插入基因簇argc-argj-argb-argd-argf-argg-argh。
2.如权利要求1所述的一种高产l-精氨酸的基因工程菌，其特征在于：基因工程菌基因组中还插入ptrc-argj基因。
3.如权利要求1所述的一种高产l-精氨酸的基因工程菌，其特征在于：ep-bifido途径的引入方式为：敲除pfka基因、edd基因，并在基因组中整合上fxpk-fbp基因。
4.如权利要求1所述的一种高产l-精氨酸的基因工程菌，其特征在于：底盘菌为大肠杆菌w3110δlaci...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，叶炜杰，王丽娟，杨焜，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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