【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及pcr步移，具体涉及一种基于n7hw-pcr的基因组步移引物及方法。
技术介绍
1、目前,自然界中绝大多数生物的全基因组dna序列仍然未知。要获取一段已知区域的未知侧翼序列,基因组步移技术是一种非常有效的方法，它已成为分子生物学研究的常用手段。其中，基于pcr的技术因简单有效，已成为主流基因组步移方法。根据其原理，已有的pcr基因组步移方法可分为两大类：第一类是酶切-连接介导的pcr，如反向pcr、接头pcr等；第二类为随机引发pcr,如热不对称交错pcr、腕表pcr、杈状pcr等。第一类方法(即酶切-连接介导的pcr)在实际应用中存在多种缺陷，如对基因组质量要求高、需要酶消化和连接处理、操作较昂贵且费时耗力等。
2、第二类方法(即随机引发pcr)无需对基因组进行酶切、连接,具有操作简单、价格低廉等特点。但已有的随机引发pcr主要依据差异化扩增，对目标片段进行富集。因此，在已有的随机引发pcr方法中，非目标背景依然无法避免。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术的不足，提供一种基于n7hw-pcr的基因组步移引物及方法，通过将一级pcr的随机步移引物pwp的5’端的7个碱基简并为n7，其余部分保持不变，得到引物ds/twp；将ds/twp用于二级和三级pcr中，使得二级、三级步移引物与一级步移引物之间不完全匹配，进而使一级pcr产生的非目标产物在二级和三级pcr中不能被有效扩增而被消除，从而提高最终产物中目标dna的浓度。
2、为实现上述技
3、具体的，所述三条巢式特异性引物psp、ssp和tsp，引物长度为20-30nt，解链温度为58-68℃。
4、进一步地，所述引物pwp和简并引物ds/twp，引物长度为25nt，解链温度为58-68℃。
5、另一方面，本专利技术还给出了基于上述n7hw引物实现基因组步移的方法，包括以下步骤：
6、步骤1、一级pcr反应
7、以基因组dna为模板，用引物psp与pwp配对进行扩增；
8、一级pcr反应液中包含微生物基因组4-40ng或水稻基因组40-400ng，1×la pcrbufferⅱmg2+plus，dntp各0.2mm，psp 0.2μm，pwp 0.2μm，takara la taq热启动酶1u，并用水补充至20μl；
9、步骤2、二级pcr反应
10、以一级pcr反应产物为模板，用引物ssp与ds/twp配对进行扩增；
11、二级pcr反应液中包含0.4μl一级pcr产物，1×la pcr bufferⅱmg2+plus，dntp各0.2mm，ssp 0.2μm，ds/twp 0.2μm，takara la taq热启动酶1u，并用水补充至20μl；
12、步骤3、三级pcr反应
13、以二级pcr反应产物为模板，用引物tsp与ds/twp配对进行扩增，得到被选择性富集的目标dna产物；
14、三级pcr反应液中包含0.4μl二级pcr产物，1×la pcr bufferⅱmg2+plus，dntp各0.2mm，tsp 0.2μm，ds/twp 0.2μm，takara la taq热启动酶1u，并用水补充至20μl。
15、具体的，步骤1中所述一级pcr反应的热循环阶段为：
16、阶段1、60℃温度下进行5个高温循环；
17、阶段2、25℃温度下进行1个低温循环；
18、阶段3、60℃温度下进行35个高温循环。
19、具体的，二级和三级pcr反应的热循环阶段为：
20、pcr阶段1、60℃温度下进行1个循环，之后每个循环的退火温度降低1℃，共进行10个循环；
21、阶段2、当退火温度降至50℃后，在50℃温度下再进行10-20个循环。
22、更进一步地，上述60℃循环、50℃循环和25℃循环过程中，变性温度为95℃，持续30s；延伸温度为72℃，持续2min。
23、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
24、1、本专利技术通过将第一轮pcr的随机步移引物pwp的5’端的7个碱基简并为n7，其余部分保持不变，得到引物ds/twp；将ds/twp用于二级和三级pcr中，使得二级、三级步移引物与一级步移引物之间不完全匹配，进而使一级pcr所得非目标产物在二级和三级pcr中不能被有效扩增而被消除，相较于传统的pcr，本专利技术方法可适用于绝大多数基因组，具有引物用量少、操作简单等优点；
25、2、本专利技术采用了三个步移引物套，因此在步移实验中可以同时进行三组平行的n7hw-pcr，相较于传统的pcr，能提高步移的成功率；
26、3、本专利技术方法更具有开放性和灵活性，使用者可以根据自身需求、按照本专利技术提供的引物设计原则，设计更多的步移引物套；也可以在步移实验中只进行1-3三组平行n7hw-pcr；
27、4、本专利技术方法的步移距离高达5.0kb，显著高于常规步移方法的3.0kb，相较于常规方法，本专利技术方法的步移效率提高了近70％；
28、5、本专利技术设计的ds/twp引物可以提高pcr扩增反应的特异性和灵敏度，从而可以更准确地检测目标dna序列。
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1.一种基于N7HW-PCR的基因组步移引物，其特征在于，所述基因组步移PCR反应的引物包括三条巢式特异性引物pSP、sSP和tSP，以及步移引物pWP和ds/tWP；引物pWP用于一级PCR反应，简并引物ds/tWP用于二级和三级PCR反应；引物ds/tWP除5’端的7个碱基简并为N7外，其余部分与pWP的对应序列一致。
2.根据权利要求1所述的一种基于N7HW-PCR的基因组步移引物，其特征在于，所述三条巢式特异性引物pSP、sSP和tSP，引物长度为20-30nt，解链温度为58-68℃。
3.根据权利要求1所述的一种基于N7HW-PCR的基因组步移引物，其特征在于，所述引物pWP和简并引物ds/tWP，引物长度为25nt，解链温度为58-68℃。
4.一种采用如权利要求1-3任一项所述基因组步移引物的基因组步移方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的基因组步移方法，其特征在于，步骤1中所述一级PCR反应的热循环阶段为：
6.根据权利要求4所述的基因组步移方法，其特征在于，所述二级和三级PCR反应
7.根据权利要求5或6所述的基因组步移方法，其特征在于，所述60℃循环、50℃循环和25℃循环过程中，变性温度为95 ℃，持续30 s；延伸温度为72 ℃，持续2min。
...【技术特征摘要】
1.一种基于n7hw-pcr的基因组步移引物，其特征在于，所述基因组步移pcr反应的引物包括三条巢式特异性引物psp、ssp和tsp，以及步移引物pwp和ds/twp；引物pwp用于一级pcr反应，简并引物ds/twp用于二级和三级pcr反应；引物ds/twp除5’端的7个碱基简并为n7外，其余部分与pwp的对应序列一致。
2.根据权利要求1所述的一种基于n7hw-pcr的基因组步移引物，其特征在于，所述三条巢式特异性引物psp、ssp和tsp，引物长度为20-30nt，解链温度为58-68℃。
3.根据权利要求1所述的一种基于n7hw-pcr的基因组步移引物，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：李海星，田冰坤，陈红，王蓉蓉，潘豪，潘振康，郭新月，汤庆春，李谋，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：
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