【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，特别涉及一种诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法及其应用。
技术介绍
1、特异性细胞消融(conditional cell ablation)是研究特定细胞群体在各种器官功能中的作用的强大方法，这些功能包括细胞分化，器官生成和再生。永久性或有条件地消融靶细胞群并暂时抑制神经元活动的新兴工具展现出了广泛的应用和实用性(liu,f.,s.dai,d.feng,x.peng,z.qin,a.c.kearns,w.huang,y.chen,s.ergün,h.wang,j.rappaport,e.c.bryda,a.chandrasekhar,b.aktas,h.hu,s.l.chang,b.gao,and x.qin,versatile cell ablation tools and their applications to study loss of cellfunctions.cell mol life sci,2019.76(23):p.4725-4743.)。有条件的靶向消融是研究特定细胞谱系或组织在发育或生理过程中的作用的有力工具。
2、此外，在时间和空间上控制组织损伤并遗传去除特定细胞群体的能力在再生研究中有很大的应用(curado,s.,d.y.stainier,and r.m.anderson,nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish:a spatially and temporallycont
3、tbid源自bid，后者是一个仅含bh3结构域的促凋亡蛋白，以其结合bcl-2或bax并促进细胞死亡的能力而闻名(adams,j.m.and s.cory,the bcl-2protein family:arbiters of cell survival.science,1998.281(5381):p.1322-1326.)。它在fas或tnfr1受体的参与下被caspase8裂解激活，裂解的tbid会从胞质移动到线粒体，插入到线粒体外膜，引起线粒体释放细胞色素c。线粒体释放细胞色素c促进细胞色素c/apaf-1/caspase9复合物的寡聚化，激活caspase9，导致下游效应酶caspase3和caspase7断裂，导致细胞凋亡(wolter,k.g.,y.t.hsu,c.l.smith,a.nechushtan,x.g.xi,and r.j.youle,movement ofbax from the cytosol to mitochondria during apoptosis.j cell biol,1997.139(5):p.1281-1292.)。
4、肌肉卫星细胞，又称肌肉干细胞，决定着骨骼肌的生长和再生。骨骼肌卫星细胞被认为是成体骨骼肌细胞成肌分化的唯一干细胞来源，一般处于静息状态。在受刺激后，骨骼肌卫星细胞具有干细胞性质，可通过关键信号通路活化、增殖并分化成为肌细胞，从而参与骨骼肌的形成及损伤修复。肌肉卫星细胞的特异性消融是一种研究肌肉卫星细胞功能的有效手段，然而，目前尚未出现稳定可用的肌肉卫星细胞特异性消融动物模型。
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法。
2、本专利技术的另一目的在于提供所述诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法的应用。
3、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
4、一种诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法，包括如下步骤：
5、(1)将scei-tol2-caggs：cherry载体利用限制性内切酶nhei和bamhi进行酶切，得到酶切后的scei-tol2-caggs载体；然后以质粒pgemt-pax7bait-p2a-gap43-cherry-t2a-ert2-cre-ert2为模板，利用引物a3和引物a4进行扩增，获得cherry-t2a片段；以墨西哥钝口螈组织中的rna反转录得到的cdna为模板，利用引物a1和引物a2进行扩增，得到tbid片段；再以tbid片段为模板，利用引物a5和引物a6进行扩增，得到tbid for gibson片段(带有gibson连接所需同源臂的tbid片段)；最后将cherry-t2a片段和tbid for gibson片段连接到酶切后的scei-tol2-caggs载体上，得到scei-tol2-caggs:cherry-t2a-tbid质粒；其中，引物a1、a2、a3、a4、a5、a6的核苷酸序列分别如seq id no.1～6所示；
6、(2)将步骤(1)中得到的scei-tol2-caggs:cherry-t2a-tbid质粒和caggs:lp-egfp-lp-yap1s96a/s352a-t2a-cherry载体分别利用限制性内切酶xmali和clai进行酶切，得到tbid片段xmai-tbid-clai和xmali-vector-clai载体，然后将tbid片段xmai-tbid-clai连接到xmali-vector-clai载体上，得到scei-tol2-caggs:loxp-egfp-loxp-tbid质粒；
7、(3)将步骤(2)中得到的scei-tol2-caggs:loxp-egfp-loxp-tbid质粒和tol2转座酶mrna显微注射到pax7:pax7-orfbδ-p2a-memcherry-t2a-ert2-cre-ert2墨西哥钝口螈受精卵中，得到双转基因动物受精卵；然后室温常规饲养，得到双转基因动物；
8、(4)将步骤(3)中得到的双转基因动物受精卵或双转基因动物利用他莫昔芬(tamoxifen)进行药物诱导，得到所述诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型。
9、步骤(3)中所述的室温常规饲养为按常规饲养墨西哥钝口螈的方式进行饲养，具体为：在16～20℃进行孵化，直到孵化完成，发育成幼体；或将孵化完成的幼体转移到杯或者盒子里饲养，每天喂食本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
7.根据权利要求1～6任一项所述的诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法在构建诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
...【专利技术属性】
技术研发人员：费继锋，何子甜，曾佳怡，刘彦梅，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：
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