一种酮基泛解酸内酯还原酶及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物催化领域，主要涉及一种酮基泛解酸内酯还原酶及其应用。本发明专利技术提供了一种高活力的酮基泛解酸内酯还原酶ZpaAR，其与L

【技术实现步骤摘要】
一种酮基泛解酸内酯还原酶及其应用


[0001]本专利技术属于生物催化领域，主要涉及源自一种酮基泛解酸内酯还原酶及其应用。

技术介绍

[0002]D
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泛酸钙又称维生素B5，广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等行业。工业化合成D
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泛解酸内酯是采用化学法和水解酶拆分法相结合的技术路线。合成D
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泛解酸内酯从羟醛缩合开始，获得的羟基特戊醛在酸性条件下与HCN反应生成氰醇，氰醇水解闭环生成外消旋的DL
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泛解酸内酯。DL
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泛解酸内酯经内酯水解酶选择性水解D
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泛解酸内酯成D
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泛解酸，D
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泛解酸与L
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泛解酸内酯分离后再内酯化成为D
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泛解酸内酯，同时L
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泛解酸内酯经消旋化为DL
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泛解酸内酯用于后续的拆分。该工艺虽然在工业上已运用多年，但是具有能耗大、酸碱使用多、工艺复杂等不足。氧化还原酶级联催化合成D
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泛解酸内酯是一种非常有前景的生物法，该法利用L
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泛解酸内酯脱氢酶、酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶级联催化DL
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泛解酸内酯的去消旋，可替代现有的酶法选择性拆分工艺，不涉及D
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泛解酸与L
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泛解酸内酯的分离，减少了酸碱有机溶剂的使用，具有绿色、环保、安全、高效的优点。
[0003]氧化还原酶法中L<br/>‑
泛解酸内酯脱氢酶催化L
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泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，酮基泛解酸内酯还原酶将酮基泛解酸内酯还原为D
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泛解酸内酯，同时葡萄糖脱氢酶在葡萄糖存在下驱动辅酶循环。其中，将酮基泛解酸内酯不对称还原为D
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泛解酸内酯是该方法的关键步骤。目前已报道的高活力酮基泛解酸内酯还原酶为数不多，酮基泛解酸内酯还原酶的活力若不能满足多酶级联催化反应，将导致中间产物的积累，降低多酶级联的催化效率，增加后续产物分离纯化的难度。
[0004]目前尚未见源自Zygosaccharomyces parabailii的酮基泛解酸内酯还原酶的报道，也没见源自Zygosaccharomyces parabailii的酮基泛解酸内酯还原酶用于多酶级联去消旋DL
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泛解酸内酯不对称合成D
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泛解酸内酯的报道。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种酮基泛解酸内酯还原酶及其应用。
[0006]本专利技术提供了ZpaAR在催化DL
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泛解酸内酯生成D
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泛解酸内酯中的应用，所述的ZpaAR来源于Zygosaccharomyces parabailii，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]进一步的，本专利技术提供了编码ZpaAR的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]更进一步的，所述的ZpaAR用于D
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泛解酸内酯的合成，具有色、环保、安全、高效的优点。
[0009]本专利技术提供了核酸组合，其包括编码AmeLPLDH的核酸、编码BsGDH的核酸和本专利技术所述的编码ZpaAR的核酸；
[0010]所述的AmeLPLDH的编码核酸如SEQ ID NO:3所示；
[0011]所述的BsGDH的编码核酸如SEQ ID NO:5所示。
[0012]本专利技术提供了表达模块，其包括：
[0013]启动子、终止子和本专利技术所述的核酸。
[0014]启动子、终止子和本专利技术所述的核酸组合。
[0015]进一步的，所述的启动子包括但不限于T7、T7lac、Sp6、araBAD、lac、pTac。
[0016]更进一步的，本专利技术利用T7启动子进行所述核酸的表达。
[0017]一些实施例中，所述表达模块包括T7和AmeLPLDH。
[0018]另一些实施例中，所述表达模块包括T7和BsGDH。
[0019]另一些实施例中，本专利技术所述的表达模块包括T7、ZpaAR和BsGDH。
[0020]本专利技术中，所述的表达单元还包括单个或多个本专利技术所述的核酸以串联、融合表达或及其他可行方式进行组合形成的表达单元，本专利技术对此不做限定。
[0021]本专利技术所述表达模块，还可以包括复制子、终止子等调控元件，本专利技术对此不做限定。
[0022]本专利技术提供了重组载体，其包括：
[0023]载体骨架和本专利技术所述的核酸；
[0024]或载体骨架和本专利技术所述的核酸组合；
[0025]或载体骨架和本专利技术所述的表达模块。
[0026]进一步的，本专利技术所述的载体包括原核载体。更进一步的，所述的原核载体包括可用于大肠杆菌目的蛋白表达的原核载体，本专利技术对此不做限定。
[0027]本专利技术中，利用pACYCDuet
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1和pET28a对所述的核酸进行表达，所述的骨架载体与核酸的组合形式可以包括如下所示中的任意一种或多种：
[0028]pET28a
‑
AmeLPLDH；
[0029]pACYCDuet
‑1‑
ZpaAR；
[0030]pACYCDuet
‑1‑
BsGDH；
[0031]pACYCDuet
‑1‑
ZpaAR
‑
BsGDH。
[0032]本专利技术所述的载体，还包括将所述的核酸组合或表达单元与单个或多个载体骨架形成的多种形式的载体。
[0033]本专利技术提供了宿主，其转化或转染本专利技术所述的重组载体。
[0034]进一步的，所述的宿主包括但不限于大肠杆菌、酵母、动物细胞，本专利技术对此不做限定。
[0035]更进一步的，本专利技术以大肠杆菌为宿主细胞，转化或转染本专利技术所述的重组载体。
[0036]本专利技术提供了所述宿主的制备方法，包括将本专利技术所述的载体转化或转染宿主细胞。所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。本专利技术一些实施例中，所述表达系统的制备方法包括将本专利技术所述的重组载体通过化学转化的方法转化大肠杆菌BL21(DE3)。
[0037]本专利技术提供了如下I)～V)中至少一种在制备D
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泛解酸内酯中的应用：
[0038]I)、本专利技术所述的核酸；
[0039]II)、本专利技术所述的核酸组合；
[0040]III)、本专利技术所述的表达模块；
[0041]IV)、本专利技术所述的重组载体；
[0042]V)、本专利技术所述的宿主。
[0043]本专利技术提供了D
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泛解酸内酯的制备方法，其以本专利技术所述的宿主为发酵菌株，并在反应体系中加入DL...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ZpaAR在催化DL
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泛解酸内酯生成D
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泛解酸内酯中的应用，所述的ZpaAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.编码ZpaAR的核酸，其序列如SEQ ID NO:1所示。3.核酸组合，其特征在于，包括权利要求2所述的核酸，和/或编码AmeLPLDH的核酸，和/或编码BsGDH的核酸；所述的AmeLPLDH的编码核酸如SEQ ID NO:3所示；所述的BsGDH的编码核酸如SEQ ID NO:5所示。4.表达模块，其特征在于，包括：启动子、终止子和权利要求1所述的核酸；或启动子、终止子和权利要求2或3所述的核酸组合。5.根据权利要求4所述的表达模块，其特征在于，所述的启动子包括T7启动子。6.重组载体，其特征在于，包括：载体骨架和权利要求1所述的核酸；或载体骨架和权利要求3所述的核酸组合；或载体骨架和权利要求4或5所述的表达模块。7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述的载体骨架选自pACYCDuet
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1和pET28a。8.宿主，其包括转化或转染如权利要求6或7所述的重组载体。9.权利要求8所述的宿主的制备方法，其特征在于，构建含有权利要求6或7所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪钊，王泰然，章银军，应向贤，林行，张连春，陈梁，刘学愚，娄波，何敏，汪瑾，汪军，殷杭华，白彦兵，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：