醇氧化酶PcAOX的突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种醇氧化酶PcAOX的突变体及其应用，所述醇氧化酶PcAOX的突变体的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。本发明专利技术通过对醇氧化酶PcAOX的三维结构进行多方面对比分析，分析关键氨基酸位点并设计一系列突变体，得到了一个不仅具有醇氧化酶活性，且具有转酰基活性的醇氧化酶PcAOX的突变体，利用该突变体，使得合成某些特殊产物成为可能，为绿色环保合成化工原料提供了新思路和技术基础。原料提供了新思路和技术基础。原料提供了新思路和技术基础。

【技术实现步骤摘要】
醇氧化酶PcAOX的突变体及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体地说，本专利技术涉及一种醇氧化酶PcAOX的突变体及其应用。

技术介绍

[0002]醇氧化酶(Alcoholoxidases，AOX，EC1.1.3.13)是一类含有黄素腺嘌呤二核苷酸(FlavinAdeninDinucleotide，FAD)辅因子的氧化还原酶，属于GMC(glucose
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methanol
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choline)氧化还原酶超家族。其能利用氧气催化氧化醇类生成相应的醛或者酮，并产生过氧化氢。其产物对于生物化工、食品加工等领域具有重要意义。
[0003]酰基转移反应(Acyltransferreaction)是一类酰基供体上的酰基转移到酰基受体上，形成新的酯或者酰胺的反应，该反应广泛存在于生物体的生命代谢活动中，同时在有机合成，生物合成等领域具有重要应用。例如通过4
‑
氯苯甲酸甲酯为酰基受体，4
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(2
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氨乙基)吗啉合成抗抑郁重要药物吗氯贝胺(moclobemide)。
[0004]PcAOX是来源于Phanerochaetechrysosporium的醇氧化酶。2014年因其具有能够氧化甘油生成甘油醛的能力而被报道，随后MarcoW.Fraaije等人针对这一特性对该酶进行了理性改造以增强其催化氧化甘油的能力，同时还发现了该酶具有催化功能上的混杂型，不仅能催化甲醇、乙醇等氧化生成过氧化氢，也能催化其他线性多元醇的多步氧化生成相应的醛酸或者二元酸。
[0005]目前并未发现PcAOX具有转酰基活性。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术的目的之一在于提供一种醇氧化酶PcAOX的突变体，该突变体在具备醇氧化酶活力的同时，还具有转酰基活力。
[0007]实现上述专利技术目的的具体技术方案包括如下：
[0008]一种醇氧化酶PcAOX的突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0009]本专利技术还提供了上述醇氧化酶PcAOX的突变体的编码基因。
[0010]在其中一些实施例中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0011]本专利技术还提供了上述醇氧化酶PcAOX的突变体、和/或所述编码基因在催化酰基转移反应中的应用。
[0012]本专利技术还提供了插入有上述编码基因的重组表达载体。
[0013]本专利技术还提供了转入有上述重组表达载体的重组工程菌株。
[0014]本专利技术还提供了上述重组表达载体、或上述重组工程菌株在催化酰基转移反应中的应用。
[0015]本专利技术还提供了一种催化酰基转移反应的方法，使用上述醇氧化酶PcAOX的突变体进行催化反应。
[0016]在其中一些实施例中，所述催化反应为：催化苯甲醇与乙酸乙烯酯生成乙酸苯甲
酯。
[0017]在其中一些实施例中，所述催化反应为：催化苯乙醇与乙酸乙烯酯生成乙酸苯乙酯。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0019]本专利技术通过对醇氧化酶PcAOX的三维结构进行多方面对比分析，分析关键氨基酸位点并设计一系列突变体，得到了一个不仅具有醇氧化酶活性，且具有转酰基活性的醇氧化酶PcAOX的突变体，利用该突变体，使得合成某些特殊产物成为可能，为绿色环保合成化工原料提供了新思路和技术基础。
附图说明
[0020]图1为本专利技术实施例2中野生型醇氧化酶PcAOX纯化过程中各组分的SDS
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PAGE结果，其中，泳道M：marker；泳道1：总菌破碎液；泳道2：破碎后上清液；泳道3：破碎后沉淀；泳道4：纯化穿过液；泳道5～7：不同浓度的纯PcAOX酶液。
[0021]图2为本专利技术实施例2中醇氧化酶PcAOX突变体纯化过程中各组分的SDS
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PAGE结果，其中，泳道M：marker；泳道1：PcAOX
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VPN粗酶液；泳道2：PcAOX
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VPN；沉淀；泳道3：PcAOX
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VPN穿过液；泳道4：PcAOX
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VPN纯酶液；泳道5：PcAOX
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VPN粗酶液；泳道6：PcAOX
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VPN沉淀；泳道7：PcAOX
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VPN穿过液；泳道8：PcAOX
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VPN纯酶液。
[0022]图3为本专利技术实施例3中过氧化氢的标准曲线。
[0023]图4为本专利技术实施例4中以苯甲醇为酰基受体的反应结果图。
[0024]图5为本专利技术实施例4中以苯乙醇为酰基受体的反应结果图。
[0025]图6为本专利技术实施例5中PcAOX突变体(PcAOX
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VPN)的分子筛色谱图。
[0026]图7为本专利技术实施例5中PcAOX突变体(PcAOX
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VPN)分子筛样品SDS
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PAGE检测结果图，其中M为marker，泳道1
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11分别为不同时间出峰样品。
[0027]图8为本专利技术实施例5中PcAOX突变体(PcAOX
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VPN)的晶体初筛结果。
[0028]图9为本专利技术实施例5中PcAOX突变体(PcAOX
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VPN)的晶体优化示意图。
[0029]图10为本专利技术实施例5中PcAOX突变体(PcAOX
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VPN)的晶体逐步优化后的形状图。
[0030]图11为本专利技术实施例5中PcAOX突变体(PcAOX
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VPN)的晶体的结构解析图。
具体实施方式
[0031]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0032]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0033]在本专利技术中，专利技术人以PcAOX酶为目标蛋白，应用全基因合成技术获得了来源于Phanerochaetechrysosporium的PcAOX基因(GenbankID：HG425201)，并构建了pET28a(+)
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PcAOX表达载体，以E.coliBL21(DE3)为表达宿主获得了PcAOX蛋白。专利技术人通过分析野生型
醇氧化酶PcAOX(核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的三维结构，通过在数据库中进行结构对比分析，从该酶的催化活性中心进行结构与功能比对，分析发现其催化中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种醇氧化酶PcAOX的突变体，其特征在于，所述醇氧化酶PcAOX的突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。2.权利要求1所述醇氧化酶PcAOX的突变体的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。4.权利要求1所述的醇氧化酶PcAOX的突变体、和/或权利要求2或3所述编码基因在催化酰基转移反应中的应用。5.插入有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。6.转...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴斌，马云建，王永华，杨博，蓝东明，王方华，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：