基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂、制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体为一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂、制备方法及其应用。本发明专利技术中将脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出特异性水解dUTP，不水解dCTP、dTTP、dATP和dGTP；同时其95℃下酶活性半衰期不低于30分钟的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为蛋白型PCR促进剂。本发明专利技术的有益效果在于：其PCR促进剂为蛋白型PCR促进剂，通用性好，活性高，热稳定性好，可以用作各种商品化高保真型DNA聚合酶的促进剂，能提高PCR扩增产量2-6倍，并改善DNA片段有效扩增长度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的PCR促进剂制备与应用技术，尤其涉及一种基于脱氧尿嘧啶 核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂制备与应用技术，属于基因工程

技术介绍
PCR技术的出现使得体外快速制备特定DNA分子成为可能，目前广泛应用于各种 核酸扩增与检测领域，极大地促进了核酸诊断技术、现代基因工程、重组蛋白质工程的发 展。由于PCR的扩增产量、DNA有效扩增长度等受多种因素的影响，目前开发了多种改善PCR 性能的技术。这些技术主要包括优化PCR反应体系组分，例如通过加入二甲基亚砜（DMSO)、 优化镁离子浓度等。目前这些技术能够在一定程度上改善PCR性能，但也存在通用性、重复 性差等问题，特别是更换目的基因片段后，通常需要重新优化这些PCR反应条件。 作为PCR技术的核心试剂，DNA聚合酶性能的改良是PCR的核心。由于基于热循 环的PCR，高温会使PCR反应底物之一脱氧胞嘧啶核苷三磷酸（dCTP)水解脱氨，生成脱氧尿 嘧啶核苷三磷酸（dUTP)，脱氧尿嘧啶核苷三磷酸会被DNA聚合酶掺入合成的DNA分子中，掺 入DNA中的尿嘧啶碱基严重抑制DNA聚合酶活性，最终降低DNA有效扩增长度和扩增产量。 另一方面，插入DNA的脱氧尿嘧啶碱基还会与鸟嘌呤配对，导致颠换型碱基突变。然而传统 型PCR改良剂对这些问题无能为力。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷 酸水解酶（dUTPase)的蛋白型PCR促进剂、制备方法及其应用；本专利技术中的蛋白型PCR促进 剂具有通用性广、综合性能优良等特点。该蛋白型PCR促进剂不仅能显著提高多种商品化 DNA聚合酶的PCR产量，还可以增加PCR扩增片段有效扩增长度。 本专利技术蛋白型PCR促进剂的作用原理主要在于：脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶能 将脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解成脱氧尿嘧啶核苷酸，阻止尿嘧啶核苷酸掺入合成的DNA分 子中，从而消除DNA中尿嘧啶对DNA聚合酶的抑制作用，提高PCR产量和DNA有效扩增长度。 本专利技术的技术方案具体如下。 本专利技术提供一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂的制备 方法，具体步骤如下： (1)构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的重组表达质粒 基于嗜热微生物基因组信息，设计其编码的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因， 在此基础上，修改优化脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶编码基因的稀有密码子，采用全基因 合成技术合成嗜热菌株的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因，并将该基因克隆到原核表达 载体PET28,构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒； (2)重组表达脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶 将构建的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主 BL21 (DE3)，得到脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行 火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶诱导表达； (3)亲和纯化表达的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶 离心收集诱导表达脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非 变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，加热失活大肠杆菌自身蛋白，离心收集含有脱氧尿嘧啶 核苷三磷酸水解酶的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中 纯化脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶； (4)检测脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的酶活性和热稳定性，筛选出蛋白型PCR 促进剂 将纯化后脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出 特异性水解dUTP，不水解dCTP、dTTP、dATP、dGTP ;同时其95度下酶活性半衰期不低于30 分钟的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为蛋白型PCR促进剂。本专利技术中，步骤（1)中，所述嗜热微生物包括火球菌（Pyrococcus furiosus)、詹 氏产甲烧古菌（Methanococcus jannaschii)、敏捷气热菌（Aeropyrum pernix)等嗜热微生 物。 本专利技术中，步骤（2)中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将耐热型 脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达菌株培养至〇D_= 0. 4-1. 0,再加入0. 5mM诱导剂 IPTG在37°C温度下培养3小时或22°C温度下培养12小时进行诱导表达。 本专利技术中，步骤（3)中，所述非变性蛋白裂解液的组成如下：20mMpH值为8. 0的 Tris-HCl,，300mMNaCl, 0? 5mMDTT，10vol%甘油。 本专利技术还提供一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂。 本专利技术中，所述蛋白型PCR促进剂为火球菌、詹氏产甲烷古菌、敏捷气热菌脱氧尿 嘧啶核苷三磷酸水解酶，其中：火球菌、詹氏产甲烷古菌或敏捷气热菌的脱氧尿嘧啶核苷三 磷酸水解酶的氨基酸序列分别如SEQ ID N0:4~6所示；编码火球菌、詹氏产甲烷古菌、敏 捷气热菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的基因序列依次如SEQ ID NO: 1~3所示。 本专利技术还进一步提供基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂的 应用。该蛋白型PCR促进剂应用于B型DNA聚合酶的PCR反应体系中。该B型DNA聚合酶 为Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶或Vent DNA聚合酶等。 本专利技术检测脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶对PCR的促进作用的具体方法如下：在 B型DNA聚合酶催化的PCR反应体系中加入脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶，扩增目标基因。 利用1 %琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，测定脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为蛋白型PCR 促进剂对PCR的改良效果。 与现有技术相比，本专利技术具有显著进步，其可用于改善PCR扩增效果，可以大大提 高PCR扩增产量，特别适用于长片段DNA的PCR扩增反应，具体如下： (1)通用性好，由于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶针对DNA中尿嘧啶碱基对DNA聚 合酶活性的抑制缺陷，进行改良设计；因此能够显著改善多种DNA聚合酶的PCR扩增性能， 并不局限于某一DNA聚合酶，能够显著改良多种商品化DNA聚合酶的PCR扩增产量和DNA 有效扩增长度。 (2)脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶不仅能够增加PCR扩增产量，还能够增加DNA有 效扩增长度，特别适用于长片段DNA的PCR扩增。 (3)操作条件简单，无需优化，直接使用。化学型PCR促进剂的最优浓度等需要优 化，尤其是化学型PCR促进剂的最优浓度仅适用于某一 DNA扩增反应。目的DNA扩增反应 改变后，需要重新优化化学型PCR促进剂最优浓度，操作繁琐，通用性差。脱氧尿嘧啶核苷 三磷酸水解酶蛋白型PCR促进剂通用性极高，对所有DNA扩增反应均适用，且不需要优化促 进剂浓度，所有PCR扩增反应采用相同浓度的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶。 (4)脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶为蛋白型PCR促进剂，除了能够增加PCR产量和 DNA有效扩增长度外，还可以减少碱基突变，提高扩增的目的基因的保真性。【附图说明】 图1是火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶对各种核苷酸三磷酸的水解效率图。 图2是火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的热稳定性图。 图3是火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶对Pfu DNA聚合酶催化PCR的促进作 用图示。 图4是詹氏产甲烷古菌脱氧尿嘧啶核苷三本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的重组表达质粒基于嗜热微生物基因组信息，设计其编码的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因，在此基础上，修改优化脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶编码基因的稀有密码子，采用全基因合成技术合成嗜热菌株的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因，并将该基因克隆到原核表达载体pET28，构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒；(2)重组表达脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶将构建的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶诱导表达；(3)亲和纯化表达的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶离心收集诱导表达脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，加热失活大肠杆菌自身蛋白，离心收集含有脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶；(4)检测脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的酶活性和热稳定性，筛选出蛋白型PCR促进剂将纯化后脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出特异性水解dUTP，不水解dCTP、dTTP、dATP和dGTP；同时其95℃下酶活性半衰期不低于30分钟的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为蛋白型PCR促进剂。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜朋，杜飞，
申请(专利权)人：远见生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31