本发明专利技术公开了一种基于荧光淬灭定量的基因变异检测方法，主要步骤包括：1)提取样本DNA；2)扩增待测基因片段；3)与带荧光淬灭分子的探针及带荧光分子的双脱氧核苷三磷酸进行延伸反应；4)检测荧光变化，计算荧光淬灭值；5)根据步骤4)的计算结果，判断待测基因的SNP。本发明专利技术还公开了用于上述方法的寡核苷酸探针。该方法利用标记了淬灭分子的探针和标记了荧光分子的双脱氧核苷三磷酸在待测基因的特异位点上进行单碱基延伸，然后通过检测荧光淬灭值，确定探针末端延伸的碱基类型，如此提高了基因SNP检测的特异性、灵敏度、便捷性和检测效率，同时降低了检测成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测
，特别是涉及一种基因SNP (单核苷酸多态性)的检测方法及用于该方法的检测探针。
技术介绍
基因科学是生物科学的一个重要领域，人的基因密码序列及其变异会影响人体的多种生物功能和功能变异，通过检测人的基因SNP (single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)可以了解和预估人体的功能变异。当前，检测基因SNP已成为分析判断遗传病、个体化药物反应特征的重要手段，也是预测和预防许多疾病的重要手段，例如，糖尿病等内分泌疾病，以及各种肿瘤的易感因素。目前，基因SNP的检测方法主要有测序法和Taqman探针法。测序法需要使用昂贵的测序仪，检测成本较高，而且测序仪的操作使用和维护都比较复杂，因此大多数城市的医院和科研单位都没有配备测序仪。Taqman探针法的缺点是1、探针的筛选比较困难，一般一对探针需要经过多次筛选，才能选出较为合适的探针，而且经常遇到多次筛选不成功的情况；2、检测一个基因的SNP需要两个探针，因此成本较高；3、不是定点识别，因此对单碱基突变检测的灵敏性和特异性不高，容易出现假阴性或假阳性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于荧光淬灭的基因变异检测方法，该方法简便、高效、成本低，且特异性和灵敏度高。为解决上述技术问题，本专利技术的基于荧光淬灭的基因变异检测方法，包括以下步骤1)提取样本DNA ；2)以所述DNA为模板，扩增待测基因片段；3)将步骤2、的产物与带荧光淬灭分子的探针及带荧光分子的双脱氧核苷三磷酸进行延伸反应；4)检测步骤幻的延伸反应产生的荧光变化，计算荧光淬灭值；5)根据步骤4)的计算结果，判断所述待测基因的SNP。步骤幻中，所述荧光淬灭分子与所述探针的序列末端的距离为3 35bp。步骤4)中，还包括荧光淬灭值的校正步骤。可以应用外标法(即以荧光自然衰减为对照)，对荧光淬灭值进行校正。本专利技术要解决的另一技术问题是提供一种用于上述方法的寡核苷酸探针。为解决上述技术问题，本专利技术的寡核苷酸探针，是一段标记有荧光淬灭分子的由 15 45个核苷酸组成的寡核苷酸序列；所述荧光淬灭分子与所述寡核苷酸序列末端的距离为3 3^dp。本专利技术的基因变异检测方法利用标记了荧光淬灭分子的特异序列探针和荧光分子标记的双脱氧核苷三磷酸在待测基因的特异位点上进行单碱基延伸，然后通过检测在探针末端延伸的荧光分子标记的碱基的荧光淬灭值，来确定探针末端延伸的碱基类型，亦即待测基因特异位点的碱基类型。与测序法相比，本专利技术的检测方法不仅大幅节省了检测时间和成本，还能避免过度扩增带来的假阳性；而与Taqman探针法相比，本专利技术对基因SNP检测的特异性和灵敏性更高。此外，本专利技术既可以采用实时荧光定量PCR仪作为检测平台， 也可以采用普通PCR仪和荧光酶标仪作为检测平台，从而能够在各医院和科研机构普及应用。附图说明图1是本专利技术实施例1图2是本专利技术实施例1图3是本专利技术实施例1图4是本专利技术实施例1图5是本专利技术实施例1图6是本专利技术实施例2图7是本专利技术实施例2图8是本专利技术实施例2图9是本专利技术实施例2图10是本专利技术实施例的实验组1的实时荧光原始图谱； 的实验组2的实时荧光原始图谱； 的实验组3的实时荧光原始图谱； 的外标对照组的实时荧光原始图谱； 的空白对照组的实时荧光原始图谱； 的实验组1的实时荧光原始图谱； 的实验组2的实时荧光原始图谱； 的实验组3的实时荧光原始图谱； 的外标对照组的实时荧光原始图谱； i的空白对照组的实时荧光原始图谱。具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本专利技术作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例15HT2A基因的SNP检测1.样本DNA的提取取适量的人口腔上皮黏膜细胞(由JANPA DNA BASED TESTING Co. Ltd.提供)，提取其基因组DNA。2. PCR 扩增以所提取的DNA为模板，对该DNA中的5HT2A基因片段进行PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)扩增。PCR反应的引物序列如下正向引物CAAGGTGAATGGTGAGCAGA(SEQ ID NO 1)反向引物AGAGACACGACGGTGAGAGG(SEQ ID NO 2)上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR 反应体系为10 XPCR 缓冲液 1.5 μ L，25mM Mg2+L 2 μ L，IOmM dNTP 0. 3 μ L, 甜菜碱(Betaine) 2 μ L，DNA模板1 μ L，5 μ M正向弓丨物1 μ L，5 μ M反向弓丨物1 μ L，5U/μ LrTaqO. 1 μ L, H2O 6. 9 μ L, 禾只 15 μ L0PCR反应条件如表1所示表IPCR反应条件权利要求1.一种基于荧光淬灭的基因变异检测方法，其特征在于，包括以下步骤1)提取样本DNA；2)以所述DNA为模板，扩增待测基因片段；3)将步骤幻的产物与带荧光淬灭分子的探针及带荧光分子的双脱氧核苷三磷酸进行延伸反应；4)检测步骤幻的延伸反应产生的荧光变化，计算荧光淬灭值；5)根据步骤4)的计算结果，判断所述待测基因的SNP。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤幻中，所述荧光淬灭分子与所述探针的序列末端的距离为3 35bp。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤幻中，所述荧光淬灭分子为BHQl，所述荧光分子为荧光素和R6G。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，还包括应用外标法对所述荧光淬灭值进行校正。5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤4)中，还包括计算淬灭比和淬灭判别系数，所述淬灭比为荧光淬灭值与初始荧光值的比值，所述淬灭判别系数为相应通道的淬灭比与所有通道的淬灭比之和的比值。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤5)中，根据淬灭判别系数判断所述待测基因的SNP;所述淬灭判别系数在65%以上时，判定为纯合子；所述淬灭判别系数大于 35%，小于65%时，判定为杂合子。7.一种寡核苷酸探针，其特征在于，该探针是一段标记有荧光淬灭分子的由15 45 个核苷酸组成的寡核苷酸序列；所述荧光淬灭分子与所述寡核苷酸序列末端的距离为3 35bp0全文摘要本专利技术公开了一种基于荧光淬灭定量的基因变异检测方法，主要步骤包括1)提取样本DNA；2)扩增待测基因片段；3)与带荧光淬灭分子的探针及带荧光分子的双脱氧核苷三磷酸进行延伸反应；4)检测荧光变化，计算荧光淬灭值；5)根据步骤4)的计算结果，判断待测基因的SNP。本专利技术还公开了用于上述方法的寡核苷酸探针。该方法利用标记了淬灭分子的探针和标记了荧光分子的双脱氧核苷三磷酸在待测基因的特异位点上进行单碱基延伸，然后通过检测荧光淬灭值，确定探针末端延伸的碱基类型，如此提高了基因SNP检测的特异性、灵敏度、便捷性和检测效率，同时降低了检测成本。文档编号C12Q1/68G本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：石睿，黄博淳，
申请(专利权)人：上海千友生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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