具有与γ磷酸结合的电活性标记的核苷三磷酸制造技术

核苷三磷酸（ＮＴＰ）参与磷酸化反应，其中磷酸基团通过激酶从ＮＴＰ转移到底物上。在激酶反应中提供的ＮＴＰ的γ磷酸结合于电活性标记，导致该γ磷酸－电活性标记结合物从ＮＴＰ转移到底物。电活性标记是一种有机部分，如醌或硝基杂环，或者是一种金属茂，如二茂铁或二茂钴。一旦γ磷酸－电活性标记结合物通过激酶转移到电极结合的底物，磷酸化的发生就通过循环伏安法进行电化学检测。磷酸化也能够通过对携带了结合电活性标记的γ磷酸的底物进行质谱分析来检测。含有γ磷酸－电活性标记结合物的ＮＴＰ适用于检测样品中激酶存在的方法，筛选调节激酶活性的候选化合物的方法，以及适用于诊断与激酶相关的疾病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种适用于监测与磷酸化相关的事件的新的电活性核苷三磷酸 (nucleotide tiphosphate)。
技术介绍
在细胞通信网络中，许多酶和受体在“开(或上去，ση”)和“关(或下来， off” )之间转换，或换句话说，是“磷酸化的”和“去磷酸化的”。在磷酸化期间，来 自ATP的磷酰基转移至蛋白质特定的丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸残基。由于这些修饰，蛋 白质的功能或定位可以变化，这在一些情况下可以导致肿瘤蛋白的形成、异常蛋白质磷酸化是许多疾病，包括癌症、糖尿病和慢性炎性疾病的原因。量 化蛋白质激酶活性的分析方法对于理解其在这些疾病的诊断和疗法中的作用是很关键 的。目前对于检测蛋白质磷酸化的方法依赖于放射标记的ATP3、基于荧光的方法4、和 荧光共振能传递(FRET)5。近来，结合生物素的ATP分子被开发用于检测磷酸化反应6。 然而，需要用电活性或光学标记对肽进行其它修饰，这增加了成本并导致了处理过程冗 长和耗时。因此，需要开发一种监测或检测与磷酸化相关的事件的可替换方法，其能够克 服当前检测方法的至少一种缺点。
技术实现思路
现在已经开发了一种新的电活性核苷三磷酸，其适用于监测和/或检测与磷酸 化相关的事件，包括磷酸化本身的可替换方法中。因此，本专利技术一方面，提供了含有电活性标记的Y磷酸基团的核苷三磷酸结合 物(conjugate)。本专利技术另一方面，提供了一种检测激酶底物磷酸化的方法，包括(a)在电极表面固定底物；(b)在允许检测磷酸化活性的条件下，用激酶和含电活性标记的Y磷酸的核苷 三磷酸结合物孵育固定的底物；(c)检测底物的磷酸化。一方面，磷酸化通过电化学方法检测。另一方面通过光谱法，包括质谱法检测磷酸化。本专利技术另一方面，提供了一种检测样品中感兴趣的激酶的方法，包括(a)在电极表面上固定对感兴趣的激酶特异的底物；(b)在允许检测磷酸化活性的条件下，用样品和含有电活性标记的Y磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的底物；和(c)检测底物的磷酸化，其中底物的磷酸化指示样品中激酶的存在。本专利技术另一方面，提供了识别候选激酶底物的方法，包括(a)在电极表面上固定候选激酶底物；(b)在允许检测磷酸化活性的条件下，用含激酶的电解液和含有电活性标记的 Y磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的底物；和(c)检测底物的磷酸化，其中候选底物的磷酸化指示所述候选物质是激酶的底 物。本专利技术另一方面，提供了一种筛选调节激酶活性的候选化合物的方法，包括(a)在电极表面上固定激酶底物；(b)在允许检测磷酸化活性的条件下，用激酶、候选化合物和含有电活性标记的 Y磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的底物；和(c)检测底物的磷酸化水平，其中，在缺乏所述化合物时，磷酸化水平从一个磷 酸化水平实现变化指示所述化合物调节所述激酶的活性。本专利技术另一方面，提供了一种高通量筛选样品中存在蛋白激酶的方法，包括(a)提供一种包含多个电极的微电极阵列；(b)将激酶底物固定于阵列中的每一电极上；(c)用感兴趣的样品和含有电活性标记的Y磷酸的核苷三磷酸孵育携带所述用 感兴趣的样品固定的底物的所述微电极阵列；和(d)检测每一电极中底物的磷酸化水平，其中在多个电极中的一种或多种底物的 磷酸化指示在样品中存在对一种或多种磷酸化底物特异的激酶。本专利技术另一方面，提供了一种诊断对象中与蛋白激酶的水平异常或缺乏相关的 疾病的方法，包括(a)将与疾病相关的激酶的底物固定于一个或多个电极上；(b)用来自对象的样品和含电活性标记的Y磷酸的核苷三磷酸孵育携带固定底 物的一个或多个电极；(C)检测每一阵列的电极中底物的磷酸化水平，其中相对于正常对照，在对象样 品中的异常磷酸化水平或缺乏磷酸化指示所述对象患有或易于患上所述疾病。另一方面，提供了一种包含至少一种固定于电极表面的激酶底物的激酶生物传 感器，其中所述电极表面浸没于包含具有电活性标记Y磷酸的电活性核苷三磷酸的电解 液中。又一方面，提供了一种筛选激酶磷酸化的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含至少一种激酶底物、电极、含电活性标记的Y磷酸基团的核苷三磷酸结合物和一种激酶。这些方面的至少一些的一个或多个优点包括(i)适用于监测和/或检测与磷酸 化相关的事件，包括磷酸化本身的新的电活性核苷三磷酸结合物，Gi)与其它监测和/或 检测磷酸化的方法相比，新的电活性核苷三磷酸结合物可以以非常低的成本生产，(iii) 检测或监测与磷酸化相关的事件，包括磷酸化本身的事件的方法并不需要用电活性或光 标记来修饰肽，和(iii)新的电活性核苷三磷酸结合物有助于、简化和加速包括监测和检测磷酸化事件包括磷酸化本身的步骤。具体而言，本专利技术的新的电活性核苷三磷酸结合物能够用于发现新药，分子诊断剂和分子靶向。本专利技术的这些和其它方面通过以下的详细描述和接着的附图会更加清楚，其 中附图说明图1是示出了电活性二茂铁-ATP结合物合成的示意图；图2是示出了电化学检测底物磷酸化的方法中金属茂-ATP结合物用途的示意 图；图3示出了在图2的方法中采用各种二茂铁-ATP浓度(a d)获得的循环伏安 图；图4示出了在图2的方法中存在(a)和不存在(b)PKC下获得的循环伏安图；图5示出了在图2的方法中存在(a)和不存在(b)的PKC下获得的方波伏安图；图6图形示出了电流密度依赖于图2的方法的反应时间的响应；图7示出了微电极阵列；和图8 (A-D)示出了微电极阵列的用法。图9 (A)示出了在含有(a)过表达(over-expressed) CK2 α，(b)内源性 CK2 水平，(C)过表达激酶-死CK2ci，(d)正常表达的CK2ci的细胞溶解产物中实施的CK2-催 化磷酸化反应的方波伏安图。图9 (B)是检测Hela细胞溶解产物中CK2 α过表达状态的图表。图10(A)是在不同CK2 α ‘浓度的(a)-(e)存在下和在酶不存在(f)下，底物肽 的CK2 α ‘-催化的磷酸化的循环伏安图；图10(B)说明(a)在分析缓冲液中，(b)在HeLa细胞溶解产物存在下和(c)在 对照实验中采用底物肽修饰的电极时CK2 α ‘浓度对电流响应的影响。图Il(A)说明在抑制剂，(1)在不同浓度(a) (e)的TBB(4，5，6，7-四 溴-2-氮杂苯并咪唑)存在下和在CK2ci不存在的对照(f)实验中，底物肽CK2ci-催化 的磷酸化的抑制作用的循环伏安图。图11 (B)说明检测CK2 α ‘-催化的磷酸化的动力学的双倒数作图 (Lineweaver-Burk plot)。图11 (C)示出了图11 (A)的对照实验。图12(A)示出了在 AbIl-T315I(a)_(d)存在下和 AbIl_T315I 不存在(e)下，用 信号转导蛋白(STP)肽对酪氨酸激酶-催化的磷酸化的抑制作用的CV。图12 (B)示出了固定STP肽的AW1-T315I-催化磷酸化的动力学测定的双倒数作图。图12 (C)示出了在具有STP肽(a)、(b)的HeLa细胞溶解产物存在下和对照实 验(C)，阳极电流依赖于AW1-T315I激酶的量的响应的图。图12 (D)示出了电流依赖于一般蛋白激酶抑制剂(b)和(C)和对照实验(a)浓度 的响应的图。图13 (A)示出了在不同浓度(a)、(b)和(C)的HER2/ErbB2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核苷三磷酸结合物，含有电活性标记的γ磷酸基团。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：海因茨伯恩哈德克拉茨，卡甘克尔曼，宋海峰，
申请(专利权)人：海因茨伯恩哈德克拉茨，卡甘克尔曼，宋海峰，
类型：发明
国别省市：CA