5＇-脱氧核苷单磷酸的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种５′－脱氧核苷单磷酸的制备方法，所述的方法包括以下步骤：（１）将２′－脱氧核苷、三氯氧磷和磷酸三烷基酯混合，得到含有５′－脱氧核苷酸粗品的溶液；（２）使步骤（１）得到的含有５′－脱氧核苷酸粗品的溶液在ｐＨ≥８．０进行水解，得到水解液；（３）将有机溶剂和步骤（２）的水解液混合、萃取，得到有机相和水相；所述的有机溶剂是卤代烃；（４）浓缩水相得到浓缩液；和（５）步骤（４）得到的浓缩液在１０至１５℃得到固体５′－脱氧核苷单磷酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化学合成领域，特别涉及化学合成5'—脱氧核苷单磷酸的制备 工艺。
技术介绍
基于脱氧核苷和脱氧核苷酸及其衍生物的药物是一类新兴的生化药物，近 年来在生物医药领域的研究及应用发展迅猛，有研究表明基于此类的生物制药 将在未来人类抗肿瘤等方面发挥重要作用。目前在抗癌、抗病毒、抗真菌、抗 细菌、治疗心肌梗塞、作为干扰素诱导剂及基因治疗等方面的研究正在不断深 入，疗效亦很明显，并在临床上得到广泛应用(例如抗癌药5-FdUR、治疗艾滋 病的扎西他宾等)，随着此类药物研究的不断深入，除使用天然脱氧核苷、脱 氧核苷酸作为原料外，更大量使用新设计的化合物、经化学修饰的脱氧核苷和 脱氧核苷酸为原料。因此5' —脱氧核苷酸作为基础原料，将具有非常广阔的前 景。目前常用的制备方法大致有以下几种-1. 微生物发酵法主要利用微生物菌株的生物合成途径来制备5' —脱氧核 苷酸。对于核苷类物质，比较容易透过微生物细胞，因此利用此法生产核苷比 较容易。但核苷酸类物质极性较大，较难透过细胞膜，因此增加了菌体发酵制 备脱氧核苷酸的难度。目前仅适用于制备部分脱氧核苷酸，国外也有相关的专 利公告。但菌种的选择及菌株的培养有较高的技术壁垒，且不适用于规模化大 生产，成本高昂。2. 酶解法是历史悠久、技术最成熟的制备方法。以DNA为底物酶解得到。 利用桔青酶发酵得到的核酸Pl酶或从麦芽根中提前出的磷酸二酯酶进行酶解 反应，得到四种混合的脱氧核苷酸，再通过离子交换树脂分离纯化得到四种脱 氧核苷酸的纯品。在酶解过程中，鉴于酶作用的专一性，能高效率地生产出特 定的脱氧核苷酸。与此同时正因为它的专一性，它的应用面也受到很大的限制， 而且相对的生产成本较高、生产周期较长。酶催化法即酶催化核苷磷酸化法。以相应的脱氧核苷为底物，利用各种4激酶即磷酸转移酶、核糖磷酸转移酶、5'—核酸酶、酸性转移酶等进行酶催化 反应得到。目前国外也有相关的专利公告。目前使用的获得5' —脱氧核苷单磷酸的方法复杂、专一性强、生产成本高 昂、消耗大。因此，本领域迫切需要提供一种简便、适用性强的化学合成5' —脱氧核苷单磷酸的方法。
技术实现思路
本专利技术涉及一种5' —脱氧核苷单磷酸的制备方法。在本专利技术中，提供了一种5' —脱氧核苷单磷酸的制备方法，所述的方法包括以下步骤(1) 将2' —脱氧核苷、三氯氧磷和磷酸三垸基酯混合，得到含有5'—脱氧 核苷酸粗品的溶液；(2) 使步骤(1)得到的含有5'—脱氧核苷酸粗品的溶液在pH》8.0进行水 解，得到水解液；(3) 将有机溶剂和步骤(2)的水解液混合、萃取，得到有机相和水相；所 述的有机溶剂是卤代烃；(4) 浓縮水相得到浓縮液；和(5) 步骤(4)得到的浓縮液在10至15X:得到固体5' —脱氧核苷单磷酸。 在另一优选例中，步骤(1)中2' —脱氧核苷、三氯氧磷和磷酸三垸基酯的混合比例为2' —脱氧核苷磷酸三垸基酯=1: 20-30 U/V) 、 2' —脱氧核苷三氯氧磷=1: 1-3 (w/v)。在另一优选例中，步骤(1)中的混合温度为零下20至0'C。 在另一优选例中，步骤(2)中的水解温度为零下20至零下5'C。 在另一优选例中，步骤(2)中水解在pH8 —IO进行。在另一优选例中，步骤(3)中所述的卤代烃选自Cl-C4的卤代垸烃；较佳地， 为Cl-C4的氯取代烷烃；更佳地，为Cl-C4的一氯取代垸烃、或Cl-C4的二氯取代 烷烃。在另一优选例中，步骤(3)中有机相中磷酸三烷基酯含量10%以下。 在另一优选例中，步骤(4)得到的浓縮液中固体物含量3 — 15w/v^(即3 —515g核苷酸/100mL(溶液体积)。在另一优选例中，步骤(5)中使步骤(4)得到的浓縮液pH2 —5.5。 在另一优选例中，将步骤(5)得到的固体5' —脱氧核苷单磷酸和水混合，重复步骤(4)至步骤(5) 1、 2、 3、 4、 5、或6次。据此，本专利技术提供了一种简便、适用性强的化学合成5' —脱氧核苷单磷酸 的方法。具体实施例方式专利技术人经过深入的研究，惊奇地发现，2' —脱氧核苷上磷后，经过一系列 简便的纯化步骤，可以得到纯度非常高的5' —脱氧核苷单磷酸。具体地，所述的纯化步骤包括低温水解、有机溶剂萃取、水相浓縮和结晶， 尤其是专利技术人发现水相浓縮时，如果将目标物的浓度控制在一定范围内，根据 不同产品的特性，通过调整各自相应的最佳pH，可以结晶析出纯度非常高的目 标物。如本文所用，"脱氧核苷酸"包含无修饰性脱氧核苷酸和修饰性脱氧核苷 酸。所述的修饰性是指在5'-磷酸脱氧核糖中的2'位上有其它化学基团，所 述其它化学基团包括但不限于，F、 0CH2等；在碱基的5位上有其它化学基团， 所述其它化学基团包括但不限于，CH3等。如本文所用，"2' —脱氧核苷"或"脱氧核苷酸"中的碱基是腺嘌呤(A)、 胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、或尿嘧啶(U)。如本文所用，"目标物"或"目标产物"可以互换使用，都是指5' —脱氧 核苷单磷酸，其中的碱基是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟 嘌呤(G)、或尿嘧啶(U)。本专利技术提供的的5' —脱氧核苷单磷酸的制备方法，包括了上磷和纯化步骤， 具体地，经过以下步骤(1) 将2' —脱氧核苷、三氯氧磷和磷酸三垸基酯混合，得到含有5' —脱氧核苷酸粗品的溶液；(2) 使步骤(1)得到的含有5' —脱氧核苷酸粗品的溶液在pH》8.0进行水解，得到水解液；(3) 将有机溶剂和步骤(2)的水解液混合、萃取，得到有机相和水相；所 述的有机溶剂是卤代烃；(4) 浓缩水相得到浓縮液；和(5) 将步骤(4)得到的浓縮液在10至15"C结晶得到固体5'—脱氧核苷单磷酸。以2' —脱氧核苷为原料，在磷酸三垸基酯类溶剂中进行磷酸化反应；2， -脱氧核苷和磷酸三垸基酯的重量体积比为1: 20-30， 2'-脱氧核苷和三氯氧磷的重量体积比为l:卜3。通过本领域常用的检测手段，判定该磷酸化反应的进 行程度， 一般使反应进行至目标物转化率为70 — 90%以上，即5' —脱氧核苷单 磷酸粗品的纯度为70%以上；较佳地转化率为75 — 90%以上。磷酸化反应的 温度为-2(TC-(TC。磷酸三烷基酯选自磷酸三甲酯、或磷酸三乙酯。完成了上述磷酸化反应的溶液调pH》8.0，并进行低温水解；可以使用本 领域熟知的无机碱或有机碱调节pH，例如但不限于，氢氧化钠、氢氧化钾、吗 啡啉等。水解液中含目标物、相应杂质类核苷、相应杂质类核苷酸(例如但不 限于，3' —脱氧核苷酸、或3'， 5' —脱氧核苷酸)、相应杂质类碱基、氯化钠、 磷酸盐等物质；优选水解温度为-2(TC至-5°C。用有机溶剂萃取出水解液中的磷酸三烷基酯类溶剂；其中水溶液中含目标 产物、相应杂质类核苷、相应杂质类核苷酸、相应杂质类碱基、氯化钠、磷酸 盐等物质；有机相中磷酸三垸基酯含量10%以下，从而避免了该种溶剂的残留 进而影响结晶的效果。水溶液浓縮至一定浓度，浓度为3-15%的含固量；较佳地为5-10%。可以 使用本领域熟知的方式进行浓缩，例如但不限于，减压浓縮。将得到的浓縮液pH调至2 — 5.5;釆用低温搅拌后即得目标产物5'-脱氧 核苷单磷酸；结晶温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种５′－脱氧核苷单磷酸的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：　（１）将２′－脱氧核苷、三氯氧磷和磷酸三烷基酯混合，得到含有５′－脱氧核苷酸粗品的溶液；　（２）使步骤（１）得到的含有５′－脱氧核苷酸粗品的溶液在ｐＨ≥８ ．０进行水解，得到水解液；　（３）将有机溶剂和步骤（２）的水解液混合、萃取，得到有机相和水相；所述的有机溶剂是卤代烃；　（４）浓缩水相得到浓缩液；和　（５）步骤（４）得到的浓缩液在１０至１５℃得到固体５′－脱氧核苷单磷酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：单永磊，
申请(专利权)人：上海兆维科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]