本发明专利技术涉及生物制品检测领域，具体提供了一种定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法。所述方法通过在免疫琼脂板的制板成份中加入合适浓度的聚乙二醇(PEG-6000)，显著的提高了SRID反应速度且更稳定、准确，同时能很好的检测通过甲醛处理的抗原；通过对成品疫苗的前期特别处理，本方法能较好的检测成品疫苗，扩大了SRID检测范围。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制品检测领域，具体地说，涉及一种定性定量分析禽用禽流感病 毒抗原有效成分的方法。
技术介绍
目前，我国禽用禽流感病毒灭活抗原的检测方法主要有免疫攻毒动物法、血凝和 血凝抑制试验。以上方法人工成本高、效率低、检测步骤繁琐，准确度难以保证，主要表现在 以下几个方面：（1)血清学方法，即血凝（HA)和血凝抑制试验（HI)，该试验必需新鲜鸡红细 胞，而结果判读受细胞质量、操作者主观性影响较大；(2)免疫攻毒法，该试验人工成本高、 耗时长，动物试验本身受干扰因素多。禽用禽流感病毒灭活疫苗质量控制对于我国动物禽 流感的防控具有举足轻重的作用，采用单向免疫扩散（SRID)定性、定量检测禽用禽流感病 毒灭活抗原有效成份的方法，利用抗原抗体表位特异性反应的原理，只要存在免疫原性表 位即可检测，不存在误检、漏检问题；该方法耗时短，批量检测样本多，疫苗的质量能得到批 量控制。 单向免疫扩散（SRID)分析禽用禽流感病毒抗原有效成分是基于有活性的抗原成 分血凝素（HA)含量，而不能检测已经失活的HA，因此，SRID检测抗原有效成分是经典而可 靠的方法；而现有的SRID定性定量分析病毒抗原试验方法反应缓慢、具有易变性和有限检 测范围、不能检测成品疫苗。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种改良SRID方法定性 定量分析禽用禽流感病毒灭活抗原有效成份的方法。 为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下： 一种，包括以下步骤： (1)制备含PEG-6000的免疫琼脂板； (2)样品的处理（成品疫苗特别处理）； (3)加样扩散； (4)漂洗、干燥、染色、脱色； (5)测量，绘制标准抗原回归曲线，计算浓度。 进一步地，所述免疫琼脂板中PEG-6000的浓度为2%-3% (百分号" ％"是指 IOOmL溶液中含有溶质的克数）。 进一步地，所述步骤（1)中的免疫琼脂板为25.4父76.2111111(1"\3")，厚度为 lmm-1. 2mm ; IOmL琼脂糖溶液冷却至56 °C左右，加入200 μ L标准抗体；3mm直径孔，孔间距 5mm 〇 进一步地，步骤（2)中所述的样品包括标准抗原和待测样品；所述标准抗原为标 准禽流感灭活病毒抗原，经稀释处理形成浓度梯度；所述待测样品为禽用禽流感成品疫苗 或禽流感灭活病毒抗原。 当待测样品为禽用禽流感成品疫苗，须经特别处理：将苯酚按1/5比例加入成品 疫苗中，充分震荡混匀后，1000 Orpm离心3分钟，取上清水相4°C保存备用待检。 当灭活病毒抗原浓度低于4. 5 μ g/ μ L或者HA效价浓度log2低于7时需浓缩处 理，具体浓缩方法如下： (1)超滤法：将待检样品5000rpm离心10min ;取上清，加入超滤离心管（100KD，再 生纤维膜）中，4000rpm离心至中间套管内至合适体积为止。 或（2)超速离心法：将待检样品用5000rpm离心10min ;取上清，加入超速离心管 内，4°C 25000rpm(82700g)离心2h，然后加入适量PBS稀释，4°C溶解2h或过夜。 进一步地，所述步骤（3)具体为：将梯度稀释的标准抗原、待检样品和阴性对照在 免疫琼脂板中加样；所述梯度稀释的标准抗原、待检样品须在同一个反应板上，每个加样孔 加样10 yL。扩散条件为：室温（20-25°C )反应12h-16h。 进一步地，步骤（4)中的所述漂洗为：将免疫琼脂板放入PBS中室温浸泡2h，以去 除血红蛋白而不改变扩散圈的大小和强度，期间换PBS缓冲液3-5次。 步骤（4)中的所述干燥为：从PBS中取出拨片上的免疫琼脂板，用粗滤纸吸取免疫 琼脂板水分30min以上，放入56°C干燥30min左右至滤纸完全干燥。 步骤（4)中的所述染色为：用0. 5 %考马斯亮蓝溶液染色干燥的免疫琼脂板 4-6min(5min左右）；脱色方法为用脱色液脱色15min以上直至沉淀圈外蓝色脱掉，期间适 当换脱色液。 步骤（4)中的所述脱色为：用脱色液脱色15min以上直至沉淀圈外蓝色脱掉，期间 适当换脱色液。 进一步地，所述步骤（5)具体为：用数显游标卡尺测量沉淀圈；以标准抗原形成的 沉淀环的直径对其相应的抗原浓度作回归曲线，得到直线回归方程y = ax+b，代入待检样 品孔的沉淀环平均直径，即得到待检样品抗原的含量；其中，y为标准品或样品的沉淀环直 径，X为标准品或样品的抗原含量，R 2X). 85。 本专利技术的有益效果在于： 专利技术人通过探索，在制板成份中加入合适浓度的聚乙二醇（PEG-6000)，显著的提 高了 SRID反应速度且更稳定、准确，同时能很好的检测通过甲醛处理的抗原；通过对成品 疫苗的前期特别处理，本方法能较好的检测成品疫苗，扩大了 SRID检测范围。因此，本专利技术 所采用的检测禽用禽流感病毒抗原有效成分的SRID方法，称为改良SRID方法。本专利技术采 用改良SRID方法定性、定量检测禽用禽流感病毒灭活抗原有效成份，极大的提高了其反应 速度、结果更加稳定，提高了疫苗质量控制的准确度，而且能够检测成品疫苗和经甲醛处理 的抗原，扩大了其检测范围，提高了生产检测工艺效率。 本专利技术所采用的标准抗原和特异性抗血清购自世界卫生组织WHO国际标准品供 应中心（NIBSC)，解决了特异性抗血清校准时间长的问题。【附图说明】 图1为本专利技术实施例1中SRID重复性检验结果。 图2为本专利技术实施例2中SRID检测样品结果。 图3为本专利技术实施例3中SRID检测样品结果。【具体实施方式】 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。 本专利技术中涉及到的百分号" ％"，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分 比，除另有规定外，是指IOOmL溶液中含有溶质的克数；液体之间的百分比，是指在20°C时 容量的比例。 实施例1 SRID检测禽用禽流感疫苗抗原方法的重复性检验 包括以下步骤： (1)免疫琼脂板制备、打孔； 量取甲液2. 当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备含PEG‑6000的免疫琼脂板；(2)样品处理；(3)加样扩散；(4)漂洗、干燥、染色、脱色；(5)测量，绘制标准抗原回归曲线，计算浓度。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨小蓉，潘春刚，王贺民，李浩鹏，周蕾蕾，黄文强，陈秋阁，
申请(专利权)人：乾元浩生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。