本发明专利技术公开了一种广谱型抗禽流感重组乳酸菌及其制备方法，利用禽流感NP和M1的抗原保守性以及乳杆菌作为抗原递呈载体的安全性，应用重组DNA技术构建了表达禽流感NP和M1基因的重组表达载体pW425et-NP-M1，转染至乳酸杆菌中，该重组乳酸菌可稳定表达NP-M1融合蛋白，通过口服的方式进入消化道定植后，能有效地诱导机体产生特异性细胞免疫反应和分泌特异性sIgA抗体。使用相同亚型禽流感病毒mH9N2和不同亚型流感病毒H1N1进行攻毒保护实验，与禽流感灭活疫苗相比，重组乳酸杆菌可显著提高小鼠脾脏和淋巴结中分泌IFN-γ的T细胞数量、肠内容物中sIgA含量。本发明专利技术的制备方法和生产工艺简便、安全，利于规模化生产，具有广阔的应用前景和有望产生良好的经济社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及融合基因 NP-M1，一种广谱型抗禽流感重组乳 酸菌及其制备方法。
技术介绍
禽流感是由禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的一种非常重要的传 染病。它不仅能对养禽业造成严重的经济损失，而且也严重威胁着人类的健康。目前为止， 疫苗是控制抗禽流感最为有效的手段。 禽流感主要通过黏膜途径感染机体，所以黏膜免疫系统在控制禽流感感染方面起 着关键性作用。另外，由于系统性疫苗在黏膜处不能诱导良好的保护性免疫反应，与胃肠道 外接种疫苗相比，黏膜疫苗能够产生有效的黏膜免疫和系统免疫反应，为避免反复暴露于 特定的病原体而提供保护，防止机体造成组织损伤或过度的炎症反应。但最近主要集中于 发挥体液免疫疫苗的研究，而病毒发生变异时，体液免疫不能产生交叉保护反应。所以靶向 保守的内部抗原蛋白是构建疫苗的候选抗原。原因如下，与病毒的表面蛋白相比，其保守的 内部抗原蛋白更加不会产生变异，例如表面蛋白血凝素和神经氨酸酶很容易发生变异，造 成疫苗株必须不断更新以匹配流行株;其次，在不同的流感病毒亚型之间内部蛋白高度保 守。禽流感病毒的核蛋白（nucleo_protein，NP)和基质蛋白（matrix protein，Ml)是最具 典型和吸引力的内部保守蛋白。Berthoud等的研究表明MVA表达AIV的保守内部抗原(NP和 Ml)能产生交叉T细胞反应对抗异源流感的感染。另外，临床研究已经证明，利用腺病毒载体 表达的AIVs NP能够诱导NP特异性T细胞免疫反应，且能抵抗异源AIVs感染。 乳酸菌(Lactobacillus)是可发酵碳水化合物生成大量乳酸的一类细菌的总称。 由于在人或动物体内长期定植，并且对机体产生益生作用，在国际上将他们认为是食品级 安全微生物。因具有容易培养、操作方便、安全无毒等诸多优势，在基因工程疫苗领域乳酸 菌是一种表达异源蛋白或作为活载体递呈抗原的重要工具。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种融合基因 NP-M1和一种重组乳酸菌。 一种融合基因 NP-M1，其碱基序列如序列表SEQ ID N0.1所示。 一种融合基因 NP-M1质粒，是在表达载体pW425et上插入了融合基因 NP-M1，命名为 pff425et- NP-Mlo 一种重组乳酸菌，是转化了 一种融合基因 NP-M1质粒pW425et-NP-Ml的乳酸杆菌。 所述的乳酸杆菌为植物乳酸杆菌。 所述的乳酸菌为Lb.plantarum NC8。 广谱型抗禽流感的重组乳酸菌的制备方法，它主要包括： (1) 人工合成其碱基序列如序列表SEQ ID N0.1所示的融合基因 NP-M1; (2) 将融合基因 NP-M1插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pW425et中，构建大肠杆菌- 乳酸菌穿梭表达重组质粒pW425et-NP-Ml; (3)将重组质粒pW425et- NP-M1转化至乳酸杆菌中。 本专利技术另一目的是一种重组乳酸菌在制备抗禽流感药物的应用。 -种重组乳酸菌在制备抗禽流感药物的应用。 所述的禽流感为H9N2亚型和\或!1謂1亚型。 本专利技术提供了一种广谱型抗禽流感重组乳酸菌，它是利用禽流感病毒核蛋白NP和 基质蛋白Ml的高度保守性以及乳酸菌作为抗原递呈载体的安全性，利用重组DNA技术构建 了表达NP基因和Ml基因的大肠杆菌-乳酸菌穿梭重组质粒pW425et-NP-Ml，将重组质粒转化 至乳酸杆菌中，获得了抗多种亚型禽流感病毒的重组乳酸杆菌，经过大量增菌培养后，该重 组乳酸菌通过口服的方式进入消化道定植后，表达的NP-M1融合蛋白在小鼠肠道被抗原递 呈细胞识别，有效地诱导机体产生特异性IFN-γ和slgA，有效预防不同亚型流感病毒的感 染。首次免疫连续灌胃小鼠3次，间隔2周后，加强免疫，连续灌服小鼠3次，间隔2周后，分别 感染不同亚型流感病毒1次，观察保护效果。结果显示，与禽流感灭活疫苗相比，重组乳酸杆 菌可显著提高小鼠脾脏和淋巴结中分泌IFN- γ的T细胞数量、肠内容物中sIgA含量。本专利技术 制备了广谱型抗禽流感的重组乳酸杆菌，制备方法和生产工艺相对简单，使用方式为饮水 口服，便于规模化生产和应用，具有广阔的应用前景和良好的经济社会效益。【附图说明】 图1 PMD18-T-NP-M1酶切鉴定电泳结果； 图2 pW425et-NP-Ml酶切鉴定电泳结果； 图3重组乳酸杆菌表达NP-M1融合蛋白检测结果:Western-blot结果； 图4 ELISP0T检测MLN中T细胞产生的IFN-γ ; 图5 ELISP0T检测脾脏中T细胞产生的IFN-γ; 图6小鼠肠内容物中特异性sIgA含量变化； 图7小鼠感染H9N2亚型禽流感病毒的存活率； 图8小鼠肺内H9N2亚型禽流感病毒滴度； 图9小鼠感染H1N1亚型流感病毒的存活率； 图10小鼠肺内H1N1亚型禽流感病毒滴度。【具体实施方式】实施例!融合基因 NP-M1的获得 以Genbank公布的NP和Ml基因序列（GI:DQ681212.1和JF906209.1)为模板，根据密码 子的简并性和乳酸菌表达蛋白对密码子的偏爱性，优化密码子后送往上海捷瑞生物工程有 限公司合成，且上下游加入Ndel和Hind ΙΠ 酶切位点。人工合成后的融合基因 NP-M1连接在 PMD18-T载体上，即pMD18-T-NP-Ml，采用常规酶切技术，应用限制性内切酶Ndel和Hind ΙΠ 双酶切PMD18-T-NP-M1，获得了大小为2253 bp目的融合基因 NP-M1，酶切体系如下所述。其 喊基序列如序列表SEQ ID NO. 1所不。反应条件:37°C水浴1 h。结束后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测显示，成功获得了融合 基因 NP-M1，如图1所示。 实施例2重组质粒pW425et-NP_Ml的构建 采用Ndel和Hind ΙΠ 限制性内切酶分别对pMD18-T-NP-Ml和pW425et进行双酶切，以获 得融合基因 NP-M1和pW425et表达载体片段;双酶切体系和反应条件同实施例1中所述。试剂 盒回收目的基因后，采用T4 DNA连接酶进行连接。 连接体系如下：反应条件：16°C连接2h，4°C过夜;次日常规CaCl2法转化E. col i DH5a感受态，并筛选重 组阳性菌。 质粒小量提取方法按照质粒小提试剂盒说明书操作提取，对质粒进行酶切鉴定， 结果表明成功构建了重组质粒pW425et-NP-Ml，如图2所示。 实施例3广谱型抗禽流感的重组乳酸菌的制备及表达产物检测 (1)乳酸杆菌感受态细胞制备及转化 活化Lb.plantarum NC8菌种，将其单个菌落接种到含1 %甘氨酸的MRS液体培养基(不 含葡萄糖）中，30 °C条件下厌氧培养至OD600值为约0.6时，以2%的接种量接种到MRS液体培 养基中（含有1%甘氨酸），当厌氧培养到0D6QQ值约为0.3时，4 °C条件下4500 r/min离心5 min收集菌体(除了离心步骤以外，制备感受态过程中Lb.plantarum NC8-直放在冰水混合 物中）。使用预冷的电转化缓冲液悬浮洗涤2次后，将Lb.plantarum NC8悬浮于适量电击缓 冲液中，冰浴10 min，分装本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合基因NP‑M1，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王春凤，杨桂连，杨文涛，石少华，赵亮，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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