一种制备α-1,3GT基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用技术

本发明专利技术涉及制作基因敲除动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备α-1,3GT基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用。其制备方法为：从基因组DNA中分离α-1,3GT基因，经长链PCR方法扩增获得同源臂，与抗生素耐药基因复合构建打靶载体；将打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假孕动物体内，与正常动物交配；对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得F1代杂合子；F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的纯合子动物，建系获得基因敲除动物种群。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及制作基因敲除动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备a-1，3GT基因 敲除的非人哺乳动物的方法及应用。
技术介绍
由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被广泛 用于外科的创伤修复、组织重建和组织工程的支架材料等。异种器官也早已成为解决器官 移植中供器官严重缺乏的潜在途径之一。然而，动物源性生物材料或异种器官组织应用于 人体所带来的免疫学问题直接影响着这类材料使用的安全性和有效性。异种器官移植的最 大障碍是供器官异种抗原与受者体内天然抗体结合后激活补体系统，攻击供器官而产生的 超急性免疫排斥反应（Hyperacute rejection，HAR)，其发生时间在异种移植后的几分钟至 数小时，供器官在短时间内发生功能衰竭使移植失败。动物源性生物材料虽经各种去除抗 原的处理，却难以彻底去除所有的异种抗原，残留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反应和免 疫毒性而影响创伤愈合的重要因素。 已有研宄显示异种抗原a -半乳糖基抗原（a-1，3-galactosyle，a-Gal)是动 物源性生物材料或异种器官移植超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原。a -Gal是含有聚 乳糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，广泛存在于猪和其它低等动物体 内。a -Gal 主要受 a -1，3 半乳糖基转移酶（a 1，3-galactosyltransferase, a -1，3GT 或 GGTA1)及异红细胞糖苷醋合成酶（isoglobotriosylceramide synthase 或 isogloboside 3synthaSe，iGb3S)调控。由于人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖苷转移酶基因有2个碱基 错位变异而不表达Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗a -Gal抗体（占总血清球蛋白的 1% )，因此当人体接受含有Gal抗原的生物材料或异种器官移植时会导致超急性免疫排斥 反应及慢性的免疫毒性反应。有研宄证实人血清中的抗a-Gal抗体既与a-1，3GT催化的 Gal抗原（糖蛋白）反应，也与iGb3S催化的Gal抗原（糖脂肪）反应。动物源性生物材料 或异种器官移植中Gal抗原的去除成为降低免疫排斥和慢性免疫毒性反应的关键。目前， 如何评价Gal抗原的去除和残留Gal抗原诱导的免疫毒性尚存在着瓶颈。由于野生型低等 动物都表达a -Gal抗原，因此无法利用野生型低等动物去评价a -Gal抗原相关的免疫毒 性反应，只能用狒狒作为受体来考察a -Gal抗原阳性或者异体器官的免疫毒性反应，而这 种动物稀少很难普及使用。因此，如何评价动物源性生物材料或异种器官组织的免疫毒性 存在着瓶颈。检测与监管机构因没有方法和标准可依据而无法进行有效的安全性和质量监 控，同时也限制了该类产品的研发和产业化发展。 国际上早在90年代就有通过构建a -1，3GT基因敲除小鼠，来研宄a -Gal相关的 免疫学反应，探讨不含Gal抗原的克隆动物的构建方法和可行性。早在1996年，RG Tearle 等报告了 a-l，3GT基因敲除小鼠模型的成功制作方法，为a_l，3GT基因敲除克隆猪的 构建开辟了先锋。之后开始有报告使用a-1，3GT基因敲除小鼠模型研宄其与人所诱导抗 体的相似性及其免疫学特征。Chiang TR等报告，a-l，3GT基因敲出小鼠免疫后诱导的 抗-Gal抗体与a -Gal结合的亲和性和人的抗Gal抗体相似，是能够诱导Gal抗原阳性异 种心脏补片的超急性免疫排斥反应。Chong A等报告，a_l，3GT基因敲除小鼠能够诱导自 然的抗a -Gal IgM和IgG，并呈现周龄依存性增强；在同种异体或异种补片移植后可以观 察到T-cell依存性的抗a -Gal抗体反应。这些研宄提示a -1，3GT基因敲除小鼠模型对 Gal抗原残留诱导的免疫毒性具有敏感的反应性。 a -Gal抗原引起的超急性免疫排斥反应和慢性免疫毒性的克服方法得到了深入 研宄。许多实验室采用了不同的方法对供器官或细胞进行处理，其中以酶处理法、物理化学 分离法及交联法和基因改造等方法的研宄最广泛。在2000年初研宄者们开始了 a-1，3GT 基因敲除猪的研宄，甚至a-1，3GT基因敲除牛的研宄，期望能够直接从a-1，3GT基因敲除 猪或牛获得没有Gal抗原的组织或器官，以避免动物源性生物材料及异种脏器移植的免疫 排斥反应。Dai Y及Lai L等报道，他们运用核转移技术成功培育出了 a_l，3GT基因敲除 猪（GT/KO pig)。实验研宄显示a _1，3GT基因敲除猪来源的生物材料能够显著减轻Gal抗 原诱导的超急性排斥反应。 国内关于a-1，3GT基因敲除动物模型的研宄也已起步，但进展缓慢，大部分研宄 都还停留在打靶载体构建或胚胎细胞重组的阶段。关于iGb3S基因敲除动物的研宄未见报 道。第三军医大学的张伟在博士论文中曾记述了 C57BL/6J小鼠胚胎干细胞的a-l，3GT基 因敲除的工作，成功获得了 a-1，3GT基因敲除的小鼠胚胎干细胞。作者周建在林爱星导师 的指导下曾进行了"猪体细胞a-1，3-半乳糖基转移酶基因的敲除并敲入HLA-G1基因的 研宄"，获得敲除a-1，3GT并敲入HLA-G1基因的体细胞。在2011年，南方医科大学的郑道 山硕士研宄生开展了 "利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1 ( a -1，3GT)基 因"的研宄。军事医学科学院野战输血研宄所的作者常宏宇报道了利用正负筛选打靶载体 在猪肾细胞系PK-15细胞中敲除GGTA1基因，获得了杂合子GGTA1 (+/-)PK-15细胞。戴一 凡教授早在2002年在美国留学期间就在国际上率先发表了 a _1，3GT基因敲除猪的研宄成 果。据报道戴一凡教授于2011年回到南京医科大学代谢疾病研宄中心，率领团队开始了 a-1，3GT基因敲除猪的深入研宄和育种繁殖，并很快成功迎来了首批转基因克隆猪的诞 生。 有研宄发现，a _1，3GT基因敲除的小鼠或者猪仍然表达a-Gal抗原，仍然能够 观察到轻度的免疫排斥反应。另外有研宄已经证实人的组织器官中不表达活性的iGb3， 提示由iGb3S转移酶基因转写的iGb3含半乳糖基脂蛋白可能是动物源性材料移植于人 体时造成异种免疫排斥反应的另一种外源性抗原。Milland等的研宄显示在a-l，3GT基 因敲除动物体内仍然表达低水平但有显著意义的Gal抗原。a -1，3GT基因敲除小鼠表达 iGb3S mRNA，更重要的是a-l，3GT基因敲除小鼠来源的抗体与iGb3S合成的脂肪骨架的 Gal a (1，3) Gal抗原反应。这一研宄结果提示iGb3S合成的Gal a (1，3) Gal糖脂肪抗原可 能是造成异体移植慢性免疫排斥反应的主要原因。因此，Milland等认为a -1，3GT基因敲 除动物虽然避免了急性免疫排斥反应，脂肪连接的Gal抗原是异体移植后期慢性免疫排斥 反应的根源。有学者开始研宄iGb3介导的免疫反应以及iGb3S缺损模型动物的免疫学变 化。 然而，上述的一些研宄也只限于个人的实验室研宄范围，国内还没有具有自主知 识产权的a-1，3GT基因敲除小鼠。而由于国际间技术壁皇的存在，在国内无法得到相关本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备α‑1,3GT基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建打靶载体：从基因组DNA中分离α‑1,3GT基因，经长链PCR方法扩增获得同源臂，与抗生素耐药基因复合构建打靶载体；(2)将打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假孕动物体内，与正常动物交配；(3)对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得F1代杂合子；F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的纯合子动物，建系获得基因敲除动物种群。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐丽明，邵安良，范昌发，陆艳，单永强，章娜，杨昭鹏，徐斌，张伟，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11