一种建立基于微RNA过表达的肝癌动物受精卵的方法技术

本发明专利技术涉及一种建立基于微RNA过表达的肝癌动物受精卵的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术首先构建了CAGG-pre-miR-483质粒，然后建立了过表达miR-483转基因小鼠的受精卵。本发明专利技术建立了一种基于微RNA稳定过表达的遗传改变小鼠模型，该模型是基于外源核酸序列整合入小鼠基因组实现的，该模型的建立为微RNA在肝癌中作用的在体功能研究提供了可靠的平台。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术具体涉及一种建立基于微RNA过表达的肝癌动物受精卵的方法，属于生物

技术介绍
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC,简称“肝癌”)是最常见的肝脏肿瘤。我国是乙型肝炎和酒精性肝病高发地区，肝癌发病率、死亡率较高。临床上虽已开展手术、放化疗等治疗措施，但由于肿瘤本身恶性程度高，治疗效果较差。因此，建立良好的肝癌动物模型对新药研发及转化医学研宄是至关重要的。从模型动物的种属上看，由于小鼠占地小、成本低、繁殖快，与人类基因组高度同源及相似的病理学特征等特点被广为使用。但上述肝癌动物模型存在操作繁琐、无法传代、对操作者要求高等不足。随着上世纪80年代转基因小鼠(Transgenic mice)的建立，利用遗传改变动物(Genetics Modified Animals, GM Animals)进行基因功能研宄和疾病模型的研发工作逐步展开。目前，国际权威实验动物中心美国Jackson实验室收录了 5种肝癌表型相关的遗传改变小鼠；此外，较为公认的还有HBsAg和TGF转基因小鼠，但这些小鼠仅限于编码某单一蛋白基因的转基因或敲除(knockout)。所以，建立能够网络调节HCC关键分子或通路的遗传改变小鼠将是HCC动物模型建立中需要解决的重要内容。microRNAs (miRNAs)是一类基因表达调控分子，是重要的非编码RNA(noncodingRNA)。miRNAs可通过作用于多靶标，参与疾病的多种病理改变，即呈现“一对多”的网络调控模式。我们通过小鼠原核显微注射技术建立了 miR-483转基因过表达小鼠，该小鼠肝脏能够过表达miR-483，后者的过表达能够使小鼠具有肝癌发生倾向。该小鼠是研宄肝癌发生机制及防控手段的良好工具。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可稳定过表达微RNA，用于在体研宄肝癌的动物平台。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术手段为:一种建立基于微RNA过表达的肝癌动物受精卵的方法，其特征在于:包括以下步骤:(I)构建CAGG-pre-miR-483质粒:选取NCBI上小鼠miR-483序列及其上下游各150bp的侧翼序列，设计含有EcoR I酶切位点的克隆引物，以基因组为模板，经PCR扩增上述序列，EcoR I分别单酶切得到的PCR产物与含有启动子CAGG的pCAGGs载体，CIP对载体去磷酸化，纯化后，经T4连接酶将二者连接，连接产物测序正确后转化入感受态细胞DH5 α，建立重组质粒 CAGG-pre-miR-483 ；(2)建立过表达miR-483转基因小鼠的受精卵:以Sal I/Hind III双酶切上述重组质粒，电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件，该构件包括启动子CAGG，miR-483序列及上下游侧翼序列和转录终止信号；将获得纯化的转基因构件经显微注射导入成活的受精卵中。在本专利技术中，优选的，所述的构建CAGG-pre-miR-483质粒时EcoR I分别单酶切得到的PCR产物与含有启动子CAGG的pCAGGs载体3h，CIP对载体去磷酸化lh，纯化后得到5 μ g产物，经T4连接酶将二者连接，连接产物测序正确后转化入感受态细胞DH5 α 50 μ L，涂板，次日，挑取5个菌落进行测序鉴定，确定重组质粒CAGG-pre-miR-483。在本专利技术中，优选的，所述的含有EcoR I酶切位点的克隆引物为:miR483-CL-F:ggtcGAATTCcactcctgcacggaggg?miR483-CL-R:caggtGAATTCcctgtacttggggcccgo在本专利技术中，优选的，调整所述的转基因构件的浓度至Ing?2ng/uL用于显微注射。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在:本专利技术主要是解决现有技术所存在的不足，即:作用时间短、无法传代和不能真实反应动物体内环境。本专利技术提供了一种能够稳定过表达miR-483的小鼠模型，为后续的肝癌研宄及药物筛选提供动物模型，该模型具有可稳定遗传性，自身具有一定的促进肝癌的特性，是一种新的肝癌研宄的动物模型。【附图说明】图1为显微注射用转基因构建不意图；图2为转基因型小鼠(TG)与野生型小鼠(WT)肝组织中miR-483含量图；图3为12月龄miR-483转基因型小鼠(TG)与野生型小鼠(WT)肝癌情况的比较示意图；图4为DEN诱导miR-483转基因型小鼠(TG)与野生型小鼠(WT)产生肝癌情况的比较示意图。【具体实施方式】下面通过实验并结合实施例对本专利技术做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本专利技术的保护范围。本专利技术的具体技术方案为:1、CAGG-pre-miR-483 质粒的构建选取NCBI上小鼠miR-483序列(Gene ID:723874)及其上下游各150bp的侧翼序列，设计含有EcoR I酶切位点的克隆引物，引物为:miR483-CL-F: ggtcGAATTCcactcctgcacggaggg,miR483-CL-R:caggtGAATTCcctgtacttggggcccg(下划线表示酶切位点)。以基因组为模板，经PCR扩增其序列，产物大小为237bp。EcoR I分别单酶切得到的PCR产物与含有启动子CAGG的载体pCAGGs3h，CIP对载体去磷酸化lh，纯化后得到5 μ g产物，经T4连接酶将二者连接，连接产物测序正确后转化入感受态细胞DH5 α 50 μ L，次日，挑取5个菌落，进行测序鉴定。测序结果表明，2个质粒全部与预期吻合。2、过表达miR-483转基因小鼠的建立以Sal I/Hind III双酶切上述重组质粒，电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件。该构件包括启动子CAGG，miR-483序列及上下游侧翼序列和转录终止信号bGHpA(图1)。调整该构件的浓度至Ing?2ng/uL。首日13时选取B6雌性小鼠，注射5IU PMSG ;隔日12时注射5IU HCG,并与雄性B6小鼠合笼。同时将发情雌性ICR小鼠与结扎输精管的ICR雄性小鼠合笼。第四日将见栓B6小鼠颈椎离断处死，仰卧位开腹，剪取输卵管近卵巢端0.5cm置于生理盐水中。将全部输卵管依次置于含透明质酸酶的胚胎培养液中分离受精卵，进行体外培养。13时进行显微注射。将经显微注射后成活的受精卵移植于见栓的ICR的输卵管壶腹部，术中注意操作轻柔和保温。3周后，ICR小鼠分娩。乳鼠生后3w用耳标为其编号，并剪取0.5cm左右尾尖进行外源基因在基因组整合的鉴定。3、gDNA的提取与筛选将小鼠尾尖置于0.5mL消化液中，55°C消化3h。加入等体积PCI，1.5X104rpm离心lOmin，上清移入新管，加0.4mL异丙醇，翻转，离心5min。以70%乙醇溶液冲洗沉淀，离心后晾干。加入170UL1XTE，震荡混匀。以gDNA为模板，用筛选引物扩增转基因片段。PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，观察外源转基因是否整合入基因组中。所用到的筛选引物为:miR483-C0_F:gccttcttctttttcctacagctc，miR483_C0-R:catcgctgaactgtgacaggaag，成功地扩增出转基因片段，产物大小为249bp，表明外源转基因已成功整合入基因组。4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立基于微RNA过表达的肝癌动物受精卵的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)构建CAGG‑pre‑miR‑483质粒：选取NCBI上小鼠miR‑483序列及其上下游各150bp的侧翼序列，设计含有EcoR I酶切位点的克隆引物，以基因组为模板，经PCR扩增上述序列，EcoR I分别单酶切得到的PCR产物与含有启动子CAGG的pCAGGs载体，CIP对载体去磷酸化，纯化后，经T4连接酶将二者连接，连接产物测序正确后转化入感受态细胞DH5α，建立重组质粒CAGG‑pre‑miR‑483；(2)建立过表达miR‑483转基因小鼠的受精卵：以Sal I/Hind III双酶切上述重组质粒，电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件，该构件包括启动子CAGG，miR‑483序列及上下游侧翼序列和转录终止信号；将获得纯化的转基因构件经显微注射导入成活的受精卵中。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马宁，高旭，刘彦虹，张艳芬，颜炳柱，邱前义，周凌云，王磊，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23