一种制备DcR3抗原的方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体公开了一种制备DcR3抗原的方法。本发明专利技术的制备方法为：从人DcR3基因全长ORF克隆上扩增获得DcR3基因；将DcR3基因通过双酶切位点Hind3和NCO1插入pET-32a（+）表达载体中获得含有DcR3基因的重组质粒；通过降低培养温度和诱导剂的浓度，增加培养时间等方法，获得可溶性DcR3，并通过梯度咪唑洗脱液进行洗脱的简单纯化后，获得较纯的DcR3抗原。本发明专利技术通过降低培养温度和诱导剂的浓度，增加培养时间等方法，获得可溶性DcR3，并通过简单的纯化后，获得较高纯度的DcR3抗原。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种制备DCR3抗原的方法。 【
技术介绍
】 蛋白质抗原为可溶性抗原，可以通过以下方式制备：（1)天然蛋白质。天然蛋白 结构正确，活性稳定，是良好的抗原，但是其来源于组织和细胞，成分复杂，难以分离纯化； 重组蛋白质。随着基因工程技术的发展，重组蛋白质已经成为制备抗原的主旋律。目前， 重组蛋白表达系统主要有原核表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳细胞表达系统 等。其中大肠杆菌（E.C0LI)原核表达系统是应用最广泛的表达系统，此系统的优点是遗传 背景相对清楚，具有使用安全、操作简单、生产量大、生产成本低、周期短等特点。但是大肠 杆菌表达的重组蛋白往往形成结构错误、没有活性的包涵体，不能用作免疫原；（3)人工合 成多肽。为了制备特异针对某一抗原表位(抗原决定簇）的抗体，可以制备人工表位肽用于 免疫。但是多肽分子一般8~20个氨基酸，分子量太小，很难引起机体的免疫反应，所以合 成的多肽需要与一个载体蛋白连接以增强其免疫原性，常用的载体蛋白有：BSA(牛血清白 蛋白）、0VA(卵清蛋白）、KLH(KnoweyholeLimpetHemocyanin，钥孔戚血蓝蛋白）、RSA(兔 血清白蛋白）、HSA(人血清白蛋白）、GST(谷胱甘肽S转移酶)、MAP(多价抗原肽，主要指多 聚Lys)。目前，这种方法的成本较高且制备出的抗体亲和力较低。 恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的一大类疾病，大多数患者的恶性肿瘤被发现 时已经到晚期，治疗效果非常不理想。早期发现和诊断，是提高恶性肿瘤治疗效果的手段之 一。死亡诱骗受体3(DecoydeathReceptor3,简称DcR3)，也称TR6,是近年来发现的肿瘤 坏死因子超家族（TNFsuperfamily)成员之一。近年来研究证明，DcR3在肺癌、肝癌、食道 癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、神经胶质瘤等多种恶性肿瘤中呈现高表达，是一 种罕见的，独特的广谱肿瘤的标志分子。以DcR3作为免疫原制备抗DcR3单克隆抗体可以 检测DcR3的表达水平，为癌症的早期发现、诊断及治疗提供关键数据。 由于DcR3基因存在较多的大肠杆菌稀有密码子及其表达蛋白含有较多的二硫 键，DcR3在大肠杆菌表达系统中表达量较低，而且形成没有活性的包涵体，不能用作免疫原 制备抗DcR3的单克隆抗体。目前，用原核细胞制备人DcR3抗原存在两大问题，一是DcR3 蛋白产量较低，杂蛋白多，难以分离纯化；二是其表达的DcR3为没有活性的包涵体，不是人 DcR3的正确结构，不能用作免疫原制备单克隆抗体。 【
技术实现思路
】 本专利技术的目的在于提供。 本专利技术的目的通过以下技术方案实现：，包括如下步 骤： (l)PCR扩增DcR3基因：根据DcR3基因的序列设计引物，以人DcR3基因全长0RF 克隆为模板，扩增DcR3基因； (2)将DcR3基因插入pET-32a( + )表达载体：用Hind3和NC01分别双酶切DcR3 基因和pET-32a( + )后用T4DNA连接酶进行连接，然后转化到大肠杆菌BL21中，转化菌命 名为dBL;提取转化菌的重组质粒，进行双酶切以及测序验证； (3)DcR3基因的可溶性表达：将dBL单克隆接种于LB培养基中过夜培养，得到菌 液；取菌液加到LB培养基中培养至0D_=0. 6时，加入IPTG至浓度为0. 2mM，培养后离心，取 沉淀，用PBS重悬；破碎后离心，取上清液进行蛋白电泳，得到可溶性DcR3; (4)DcR3的纯化：按DcR3基因的可溶性表达条件培养dBL，破碎后将上清液与镍 树脂混合，用咪唑洗脱液进行洗脱，取咪唑洗脱液进行蛋白电泳，得到DcR3蛋白。 步骤（1)中所述引物为： 上游引物为CATGCCATGGTGGCAGAAACACCCACCTACC，下游引物为 CCCAAGCTTGTGCACAGGGAGGAAGCGCTC〇步骤（3)中： 所述LB培养基为含50ug/ml氨节青霉素（Ampicillin)的LB培养基； 所述培养的条件为16°C、160rpm; 所述菌液与LB培养基的用量为250ul:5ml; 所述培养后离心为在16°C、160rpm中培养20小时后离心； 所述离心的条件为于8000rpm离心5min; 步骤（4)中所述咪唑洗脱液为50mM、150mM、200mM和500mM的咪唑洗脱液。 本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及有益效果： 由于DcR3基因存在较多的大肠杆菌稀有密码子及其表达蛋白含有较多的二硫 键，DcR3在大肠杆菌表达系统中表达量较低，而且形成没有活性的包涵体，不能用作免疫原 制备抗DcR3的单克隆抗体。本专利技术通过降低培养温度和诱导剂的浓度，增加培养时间等方 法，获得可溶性DcR3,并通过简单的纯化后，获得较高纯度的DcR3抗原。 【【附图说明】】 图1是实施例1的DcR3的PCR扩增结果图；其中：M为DNAmarker;1为DcR3基 因。 图2是实施例1的重组质粒验证的结果图；其中：M为DNAmarker;1为重组质粒； 2为质粒双酶切验证结果。 图3是实施例1的可溶性DcR3的表达结果图；其中：M为proteinmarker; control为空载体转化BL21破碎上清液；1为dBL破碎上清液含有DcR3。 图4是实施例1的DcR3的纯化结果检测图；其中：M为proteinmarker;1为经 50mM咪唑洗脱液洗脱蛋白的检测结果；2为经150mM咪唑洗脱液洗脱蛋白的检测结果；3为 经200mM咪唑洗脱液洗脱蛋白的检测结果；4为经500mM咪唑洗脱液纯化DcR3的检测结果。 【【具体实施方式】】 下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的保护范围并不 限于此。 实施例1 -种制备DcR3抗原的方法，包括如下步骤： (1) PCR扩增DcR3基因：根据DcR3基因的序列设计引物；上游引物：CATGCCATGGTGGCAGAAACACCCACCTACC，下游引物：CCCAAGCTTGTGCACAGGGAGGAAGCGCTC; 以人DcR3基因全长0RF克隆（SinobiologicalInc.)为模板，扩增DcR3基因； DcR3基因的扩增结果图如图1所示；从图1可以看出，该步骤成功扩增出816bp的DcR3基 因。 人DcR3基因全长0RF克隆的序列如下：【主权项】1. ，其特征在于，包括如下步骤： (I )PCR扩增DcR3基因：根据DcR3基因的序列设计引物，以人DcR3基因全长ORF克隆 为模板，扩增DcR3基因； (2) 将DcR3基因插入pET-32a ( + )表达载体：用Hind3和NCOl分别双酶切DcR3基因 和pET-32a ( + )后用T4DNA连接酶进行连接，然后转化到大肠杆菌BL21中，转化菌命名为 dBL ;提取转化菌的重组质粒，进行双酶切以及测序验证； (3) DcR3基因的可溶性表达：将dBL单克隆接种于LB培养基中过夜培养，得到菌液；取 菌液加到LB培养基中培养至OD6tltl=O. 6时，加入IPTG至浓度为0. 1-0. 3mM，培养后离心，取 沉淀，用PBS重悬；破碎后离心，取上清液进行蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备DcR3抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）PCR扩增DcR3基因：根据DcR3基因的序列设计引物，以人DcR3基因全长ORF克隆为模板，扩增DcR3基因；（2）将DcR3基因插入pET‑32a（+）表达载体：用Hind3和NCO1分别双酶切DcR3基因和pET‑32a（+）后用T4DNA连接酶进行连接，然后转化到大肠杆菌BL21中，转化菌命名为dBL；提取转化菌的重组质粒，进行双酶切以及测序验证；（3）DcR3基因的可溶性表达：将dBL单克隆接种于LB培养基中过夜培养，得到菌液；取菌液加到LB培养基中培养至OD600=0.6时，加入IPTG至浓度为0.1‑0.3mM，培养后离心，取沉淀，用PBS重悬；破碎后离心，取上清液进行蛋白电泳，得到可溶性DcR3；（4）DcR3的纯化：按DcR3基因的可溶性表达条件培养dBL，破碎后将上清液与镍树脂混合，用咪唑洗脱液进行洗脱，取咪唑洗脱液进行蛋白电泳，得到DcR3蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：万晓春，李俊鑫，阮庆国，王蒲，赵琦，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44