本发明专利技术提供了蛋白功能结构域铰链肽氨基酸序列，及由该铰链肽连接蛋白功能结构域组成的多功能结构域重组蛋白的氨基酸序列、表达基因，以及表达制备方法及其用途。本发明专利技术设计制备的多功能结构域重蛋白具有每个功能结构域发挥功能效率高的优点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了蛋白功能结构域铰链肽氨基酸序列，及由该铰链肽连接蛋白功能结构域组成的多功能结构域重组蛋白的氨基酸序列、表达基因，以及表达制备方法及其用途。本专利技术设计制备的多功能结构域重蛋白具有每个功能结构域发挥功能效率高的优点。【专利说明】-种蛋白功能结构域絞链化及其用途
本专利技术属生物工程领域，具体涉及一种连接蛋白功能结构域的较链肤，W及由该 较链肤连接蛋白功能结构域组成的多功能结构域重组蛋白的氨基酸序列、表达基因，及其 表达制备方法及用途。
技术介绍
功能结构域是生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域。天然蛋白的功能结 构域之间较链区肤段长短不等，在某些用途中不能保证结构域高效发挥生物功能。如蛋白A 是A型金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的一种细胞壁蛋白，能特异性地结合人 和哺乳动物抗体（主要是IgG)。理论上天然蛋白A所含5个功能结构域都能独立结合抗体 化区。但在溶液中每个天然蛋白A平均只能结合2. 1个抗体分子（用ITC200量热滴定测 定），相当于每个结构域只能结合0.4个抗体分子，而当蛋白A固定在琼脂糖球上时，平均每 个结构域结合的抗体降低到0. 12个分子；分析蛋白A结构发现天然蛋白A结构域之间的较 链肤最长只有13个氨基酸（结构域E-D主体结构之间的氨基酸序列；APKADAQQNNFNK)，最 伸展构象的N-C端距离只有2日A。蛋白A每个结合域的主体几何性质约为长巧A、直径约20A 的圆柱；即使在最伸展的情况下，蛋白A分子结合域的间隔约为50A (相当于结合域的长度 25A加上伸展较链长度25A之和）。而抗体分子化和两个F油结构域的立体结构相当于3 个栓在一起的长约90A、直径60A的卵形体。即使抗体分子W最紧密排列方式排列厚度也有 60A，显然超出了蛋白A分子结构域间隔的50A。任何一个结构域结合了抗体分子所占空间都 会阻碍相邻的两个结构域再结合抗体分子，降低了蛋白A分子结合抗体的效率。日本专利 JP2009 / 066553和美国专利US2006019495等用生物工程改造蛋白A增强了耐碱能力和纯 化性能。美国专利US2006019495中的四结构域蛋白A结构域间最长较链肤（氨基酸序列： APKQAPKVDAKFTVDNK)构象的N-C端距离都在27-37A之间；日本专利JP2009 / 066553中的 四结构域蛋白A的结构域间最长较链肤（氨基酸序列；APTGSSGTATAQQNNF)，构象的N-C端 距离都在17-41A之间，长度大于35AW上的几率占1 / 4,反过来看就是3 / 4的蛋白A分子 构象中结构域间隔小于60A，任何一个结构域结合了抗体分子所占空间都会阻碍相邻的两 个结构域再结合抗体分子。所W该些专利的蛋白A分子结合抗体的效率仍然有待于提高， 从而提高抗体药物的核也纯化效率，降低抗体药物生产成本，促进抗体药物产业发展，让更 多病人用得起抗体药物。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种人工设计的蛋白结构域较链肤，用于连接蛋白中 多个结构域，使每个结构域都能有效发挥生物功能。人工设计蛋白中功能结构域的大小 和发挥功能时所结合祀蛋白的大小决定着所需要的结构域较链肤的长短。如蛋白A分 子中每个结构域的主体几何性质约为长25A、直径约I 20A的圆柱；结合抗体时既是抗体分 子W最薄60A的厚度密集排列，要求蛋白A分子结构域间隔是60-25=35A。需要在蛋白A结 构域主体之间插入一定长度的较链肤才能将蛋白A结构域主体间距延长到对相邻结构 域同时结合抗体没有不利影响的程度。广泛的研究发现抗体分子Fab和Fc之间的较链 肤具有比较理想的功能。公开文献报道了不同类型和亚型抗体分子F油和化间较链肤 长度，如3x15个氨基酸巧PKSCDTPPPCPRCP)3,富含甘氨酸和脯氨酸，常见的抗体较链肤如表1所示，使用该些较长的较链肤 能够使得某些蛋白的每个结构域可W独立完成生物功能。 表1抗体来源的较链肤氨基酸序列 【权利要求】1. 一种连接蛋白质功能结构域的铰链肽，所述铰链肽伸展构象的长度大于结构域所结 合靶蛋白几何宽度与结构域几何长度的差值，其特征在于所述的铰链肽氨基酸序列选自动 物抗体分子铰链区的一部分、单拷贝和多拷贝及其组合。2. 如权利要求1所述的铰链肽，其特征在于所述的铰链肽氨基酸序列选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、 SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO ：25, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：27, SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：29, SEQ ID NO ：30, SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、 SEQ ID N0：37,SEQ ID N0：38,SEQ ID N0：39,SEQ ID N0：40,SEQ ID NO ：4U SEQ ID NO： 42、SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:46。3. 如权利要求2所述的铰链肽，其特征在于所述的铰链肽中半胱氨酸残基用小侧链氨 基酸取代，小侧链氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和天冬氨酸。4. 一种权利要求3所述铰链肽组成的，其功能结构域数目由2-6个组成并具有结合抗 体功能的重组蛋白，其特征在于所述功能结构域选自金黄色葡萄球菌蛋白A的天然蛋白A 结构域A、B、C、D、E和人工改造的结构域Z，蛋白G的Bl、B2和蛋白L的B1结构域及其衍 生物、类似物或其任意组合。5. 如权利要求4所述重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白的N-末端加一段权利要求1 所述铰链肽连接有赖氨酸和/或半胱氨酸。6. 如权利要求5所述重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白的C-末端加一段权利要求1 所述铰链肽连接有赖氨酸和/或半胱氨酸。7. -种权利要求6所述重组蛋白固定化的亲和介质，其特征在于，所述的亲和介质用 于免疫球蛋白的分离和纯化。8. -种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求4所述的重组蛋白A。9. 一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求8所述的多核苷酸。10. -种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求9所述的表达载体，或 者在基因组中整合有权利要求8所述的多核苷酸。【文档编号】C12N本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种连接蛋白质功能结构域的铰链肽，所述铰链肽伸展构象的长度大于结构域所结合靶蛋白几何宽度与结构域几何长度的差值，其特征在于所述的铰链肽氨基酸序列选自动物抗体分子铰链区的一部分、单拷贝和多拷贝及其组合。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李荣秀，陈扬扬，卢悟广，李灵舒，陈磊，
申请(专利权)人：上海亨臻实业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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