百脉根抗逆相关转录因子及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了百脉根抗逆相关转录因子及其编码基因和应用。本发明专利技术提供了核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的从百脉根中分离的ERF类转录因子基因LcERF034，所编码转录因子氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明专利技术还提供了能够与顺式作用元件结合而启动抗逆应答基因表达的SEQ ID NO.3所示的ERF类转录因子结构域。功能分析实验证明，在植物中过表达LcERF034基因能够有效提高或改善植物对包括高盐、干旱、低温等逆境胁迫的抗性，说明LcERF034基因所编码的蛋白具有ERF类转录因子的功能。本发明专利技术进一步提供了它们在提高植物对逆境胁迫抗性或培育耐逆境胁迫转基因植物新品种中的应用。

【技术实现步骤摘要】
百脉根抗逆相关转录因子及其编码基因和应用
本专利技术涉及转录因子，尤其涉及从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的与植物抗逆境胁迫相关的转录因子及其编码基因，本专利技术进一步涉及它们在提高植物抗逆境胁迫能力的应用，属于ERF类转录因子及其应用领域。
技术介绍
土壤盐碱化和次生盐碱化问题在世界范围内广泛存在，特别是干旱、半干旱地区，问题更为严重。据联合国科教文组织UNESCO、粮农组织FAO不完全统计，全球盐碱地面积已达9.5亿hm2，约占地球陆地总面积的10％，其中中国为9913万hm2，占全世界盐渍土壤的九分之一，相当于中国的18亿亩耕地面积。另外，据统计，世界干旱、半干旱地区涉及50多个国家和地区，占地球陆地面积的三分之一。而中国的干旱、半干旱地区占中国陆地面积的二分之一，年受旱面积达200-270万公顷，其危害相当于其它自然灾害之和。土壤干旱、盐碱化严重阻碍了农作物的生长，降低了农作物的产量，已经成为制约世界灌溉农业可持续发展和影响生态环境的重要因素。随着人口增加、耕地减少以及水资源的匮乏，提高水资源利用效率、充分开发和利用盐碱地有着极其重要的现实意义。盐碱地改良是世界性难题，传统措施投资大、效益低，经过数十年实践，利用基因工程技术提高植物抗旱、耐盐碱的能力，是开发利用干旱、盐碱地资源最根本、最经济、最有效的途径之一。植物抗逆性是受多基因控制的复杂数量性状，单个基因表达的增强并不能从根本上改良植物对多种不良环境的抵抗能力，而转录因子(TranscriptionalFactors,TFs)是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白，是目前抗逆研究最多、应用最广的一类基因。植物逆境抗性相关转录因子可以分：AP2/ERF、bZIP、WRKY、MYB、NAC五大类。其中AP2/ERF转录因子是植物特有的一大类超基因家族，具有非常保守的DNA结合域，特异性的与ERE、GCC-box等顺式元件结合，调控胁迫应答基因表达，是参与植物生长发育、生物/非生物胁迫应答基因表达及信号转导的重要转录调控因子。其中DREB和ERF是首要的两大类亚家族，在生物/非生物胁迫应答中发挥至关重要的作用，是提高植物抗逆性能的理想候选基因。目前已从不同物种中分离克隆了上千个DREB/ERF基因，对近200个基因进行了功能验证，转基因拟南芥、烟草等模式植物、水稻、玉米、大麦、小麦、大豆等粮食作物、番茄、马铃薯、辣椒、花生、棉花等经济作物、苜蓿、三叶草、高羊茅、百脉根等牧草中过表达在不同程度上提高了抗旱、耐盐、高温、冷冻、抗病虫等抗逆性能。尽管植物抗逆基因工程的研究取得了一些进展，但是其重点均在导入个别功能基因来提高某种抗性，从而达不到使植物的抗逆性得到综合、根本性的改良。植物抗逆相关的ERF转录因子基因的分离、鉴定及其功能分析，对阐明抗逆分子机制、有效地进行分子育种研究十分必要。百脉根(LotuscorniculatusL.)是世界范围内广泛种植的多年生优良豆科牧草，具有营养丰富、耐贫瘠、耐酸碱、耐牧和饲用安全、适口性好等优点。百脉根不仅是建设生态农业的优质草种，还是用于土壤改良的重要作物，在用作地被植物、保持水土、改良人工草场、防止土壤荒漠化等方面具有独特作用。另外，百脉根在西方国家也常被作为路旁和庭院观赏植物而栽培。因此，选择优质牧草百脉根为材料分离、鉴定AP2/ERF转录因子并分析其抗逆功能，这对农牧业生产、生态环境建设以及土壤改良等具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的与植物抗逆相关的ERF类转录因子及其编码基因。本专利技术目的之二是提供含有上述编码基因的重组植物表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。本专利技术目的之三是将所述的转录因子及其编码基因应用于提高或改善植物对于环境胁迫的抗性。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：为实现上述目的，本专利技术一方面提供了一种从百脉根(LotuscorniculatusL.)所分离的ERF类转录因子编码基因(LcERF034)，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：(a)、SEQIDNo.1所示的多核苷酸；或(b)、编码SEQIDNo.2所示氨基酸的多核苷酸；或(c)、与SEQIDNO:1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有ERF类转录因子功能；或(d)、与SEQIDNo.1所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或(e)、在SEQIDNO.1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有ERF类转录因子功能的功能或活性。本专利技术目的之二是提供由上述转录因子基因所编码的能够提高植物对环境胁迫抗性的ERF类转录因子，其氨基酸为(a)或(b)所示:(a)、SEQIDNo.2所示的氨基酸；(b)、将SEQIDNo.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有ERF类转录因子功能或活性的蛋白变体；其中，SEQIDNO.2的氨基端第130至193位氨基酸残基序列(SEQIDNO.3)为AP2/ERF结合域的编码序列，该结合域第14位(143位)氨基酸为缬氨酸(V)，第19位(148位)氨基酸为亮氨酸(L)，此类结构域能够与GCCbox顺式作用元件结合而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达。本专利技术所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备ERF转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。本专利技术所述的ERF转录因子及其编码基因包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQIDNo.2所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。本专利技术还提供了含有所述ERF转录因子编码基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。将所述ERF转录因子编码基因(LcERF034)可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，SEQIDNo.1所示的核苷酸和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区本文档来自技高网...

【技术保护点】
从百脉根(Lotus corniculatus L.)分离的ERF类转录因子编码基因，其特征在于，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：(a)、SEQ ID No.1所示的多核苷酸；或(b)、编码SEQ ID No.2所示氨基酸的多核苷酸；或(c)、与SEQ ID NO:1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有ERF类转录因子功能；或(d)、与SEQ ID No.1所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或(e)、在SEQ ID NO.1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有ERF类转录因子功能的功能或活性。

【技术特征摘要】
2013.09.23 CN 201310436229.51.从百脉根(LotuscorniculatusL.)分离的ERF类转录因子编码基因，其特征在于，其为编码SEQIDNo.2所示氨基酸的多核苷酸。2.按照权利要求1所述的ERF类转录因子编码基因，其特征在于，其多核苷酸为SEQIDNo.1所示。3.权利要求1所述编码基因编码的ERF类转录因子，其特征在于，其氨基酸为SEQIDNo.2所示。4.含有权利要求1所述编码基因的表达载体。5.按照权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体是重组植物表达载体。6.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴燕民，马德宁，孙占敏，周美亮，张永平，唐益雄，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，北京三瑞农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11