一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种酸中心复合物电化学免疫传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。基于酸中心复合物比表面积大，导电性优异，生物相容性好，氧化还原性能好等特点，显著提高了免疫传感器的灵敏度和稳定性，对肿瘤的早期诊断具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备方法及应用
本专利技术涉及一种酸中心复合物电化学免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用FAiPANIiCS-HCl制备一种检测肿瘤标志物的电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测
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技术介绍
癌症是一大类恶性肿瘤的统称。肿瘤在发生发展过程中，肿瘤细胞异常表达或宿主细胞对肿瘤反应后产生的某些物质，如肿瘤特异性抗原、胚胎抗原、某些分化抗原、激素和同工酶等，可作为肿瘤标志物，用于临床某些肿瘤的诊断和辅助诊断。因此，在临床研究上，发展一种快速、简便、灵敏的检测肿瘤标志物方法是十分重要的。 电化学免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点，因此本专利技术制备了一种合金负载分子筛电化学免疫传感器，实现了对肿瘤标志物的检测。 目前已有的肿瘤标志物的临床检测方法很多，如放射免疫分析、化学发光免疫分析、酶联免疫分析等。免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特性性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。 本专利技术采用FA@PANI@CS-HC1为基底材料，FA产生电化学信号，PANI提高电极表面的导电性和比表面积，从而利用CS-HC1良好的成膜性，实现了基底材料FA@PANI@CS-HC1对电极的良好修饰，实现了其对免疫分子的成功固定，增强了传感器的灵敏度，扩宽了线性范围，有效地降低了传感器的检出限，并可用于多种肿瘤标志物的分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，有效克服了目前肿瘤标志物检测方法的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是基于酸中心复合物FA@PANI@CS-HC1为基底材料，构建了一种无酶，无标记的快速超灵敏的电化学免疫传感器。 本专利技术的目的之二就是将Ag@Co304用于孵化抗体，实现了对肿瘤标志物的高灵敏检测。 本专利技术的目的之三就是将该无标记电化学免疫传感器用于多种肿瘤标志物的检测。 本专利技术的技术方案如下:1.一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备方法(1)将直径为4mm的玻碳电极用A1203抛光粉打磨，超纯水清洗干净；将6 μ?、0.5?2mg/mL酸中心复合物FA@PANI@CS-HC1分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜； (2)依次滴加6μ?的EDC/NHS溶液、6 μ?的Ab-Ag@Co304抗体孵化物溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干；所述EDC/NHS溶液是由0.1 mol/L的EDC和0.1 mol/L的NHS按照1?4: 1的体积比混合制得；(3)滴加6PL、质量分数为0.5%?2%的BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4V冰箱中晾干；(4)滴加6μ?、0.000Γ2 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干，制得一种基于酸中心复合物的免疫传感器。 2.酸中心复合物FA@PANI@CS-HC1分散液的制备将0.Γ2.0 mg的二茂铁甲酸FA与0.Γ2.0 mg的盐酸掺杂的聚苯胺PANI混合，分散于1 mL、0.5?10 mg/mL的壳聚糖盐酸盐CS-HC1水溶液中，震荡超声24 h，混合均匀。 3.Ab-Ag@Co304抗体孵化物溶液的制备(1)Co304纳米片的制备 在磁力搅拌下，将2.(Γ3.0 g的CoC12*6H20溶于5(T70 mL超纯水中，制得CoCl2水溶液；将20 mL、0.Γ?.0 mol/L NaOH水溶液逐滴加入到CoCl2水溶液中，继续搅拌5 min，得到棕色沉淀，离心，用超纯水和无水乙醇分别洗涤3次，在60 °C真空干燥箱中干燥12 h，制得固体沉淀物，将其在30(T50(TC下煅烧1 h，逐渐降到室温，制得Co304纳米片；(2)氨基化Co304的制备将0.1 g的Co304纳米片加入到10 mL的无水甲苯中，加入0.Γ? mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，6(T80°C回流1.5 h，离心，于110°C下干燥1 h，制得氨基化的Co304 ; (3)Ab-AgiCo304抗体孵化物溶液的制备将50 mg的硝酸银溶于50 mL、质量分数为:Γ8 %的柠檬酸钠水溶液中，搅拌1 h ;逐滴加入广5 mL、0.1 mmoL/L的硼氢化钠水溶液，搅拌2(T30 min，直至变为棕黄色，制得Ag纳米粒子溶液；将1 mg氨基化的Co304和3(T70 mL的Ag纳米粒子溶液，充分混合，震荡离心，得到AgiCo304 ;将1 mg的AgiCo304加入到1 mL、0.1?5 Pg/mL的抗体Ab溶液中，充分混勻，震荡24 h，制得Ab-Ag@Co304抗体孵化物溶液。 4.肿瘤标志物的检测(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL、50 mmoL/L.pH 6.00?8.10的PBS缓冲溶液中进行测试；(2)用方波伏安法对肿瘤标志物抗原标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.2V?0.6V ；(3)当背景电流趋于稳定后，测量抗原加入前后的传感器的峰电流值，然后记录电流变化，绘制工作曲线；(4)将待测样品溶液代替肿瘤标志物抗原标准溶液进行检测。 上述所述的肿瘤标志物选自下列之一:人核基质蛋白NMP-22，甲胎蛋白AFP，癌胚抗原CEA，乳腺癌易感基因CA15-3，糖蛋白抗原CA125、CA19_9、CA72_4和CA242，鳞状细胞相关抗原SCC，细胞角蛋白19 (CYFRA21-1)，β 2-微球蛋白，铁蛋白，前列腺特异性抗原PSA，神经原特异性烯醇化酶NSE，绒毛膜促性腺激素HCG。 本专利技术的有益成果(1)二茂铁甲酸FA是良好的电子媒介体，能够充分反映电化学反应的进程，但是其水溶性较差，故将FA与可溶性强的壳聚糖盐酸盐进行复合，形成酸中心复合物，增强FA的水溶性。壳聚糖盐酸盐的使用，能够防止传感器上的基底材料脱落，同时增强其成膜性。 (2)盐酸掺杂的聚苯胺应用到电化学免疫传感器中，能够增强电极表面的导电性，同时增大传感器的比表面积来负载更多的抗体，从而实现对肿瘤标志物的高灵敏检测。 (3) Co304纳米片，是介孔纳米材料，其大的比表面积能够增强贵金属Ag在其表面的负载量，进而促进抗体的负载量，增大传感信号，使传感器实现了对肿瘤标志物的超灵敏检测。 (4)本传感器采用无标记的方法，避免了传统标记型传感器的构建过程复杂，标记物质容易泄露，从而导致其重现性差的特点，简化了传感器的构建步骤，显著提高了电化学免疫传感器的重现性和稳定性。 (5)本专利技术利用抗原、抗体的免疫反应，提高了检测方法的特异性。 (6)本专利技术制备的电化学免疫传感器用于多种肿瘤标志物的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测，对常见肿瘤标志物检测限可达 0.21 pg/mLo 【具体实施方式】 实施例1 一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备(1)将直径为4mm的玻碳电极用A1203抛光粉打磨，超纯水清洗干净本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；将6 µL、0.5 ~ 2 mg/mL 酸中心复合物FA@PANI@CS‑HCl分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜； （2）依次滴加6 µL的EDC/NHS溶液、6 µL的Ab‑Ag@Co3O4抗体孵化物溶液于电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；所述EDC/NHS溶液是由0.1 mol/L 的EDC和0.1 mol/L 的NHS按照1 ~ 4 : 1的体积比混合制得；（3）滴加6 µL、质量分数为0.5% ~ 2%的BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；（4）滴加6 µL、0.0001~2 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干，制得一种基于酸中心复合物的免疫传感器。

【技术特征摘要】
1.一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；将6 μ?、0.5?2mg/mL酸中心复合物FA@PANI@CS-HC1分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜； (2)依次滴加6μ?的EDC/NHS溶液、6 μ?的Ab-AgOCo3O4抗体孵化物溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干；所述EDC/NHS溶液是由0.1 mo I/L的EDC和0.1 mo I/L的NHS按照I?4:1的体积比混合制得； (3)滴加6PL、质量分数为0.5%?2%的BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4V冰箱中晾干； (4)滴加6μ?、0.0OOf 2 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干，制得一种基于酸中心复合物的免疫传感器。2.如权利要求1所述的一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备方法，所述的酸中心复合物FA@PANI@CS-HC1分散液，其特征在于，制备步骤如下: 将0.Γ2.0 mg的二茂铁甲酸FA与0.Γ2.0 mg的盐酸掺杂的聚苯胺PANI混合，分散于I mL、0.5?10 mg/mL的壳聚糖盐酸盐CS-HCl水溶液中，震荡超声24 h，混合均匀。3.如权利要求1所述的一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备方法，所述Ab-AgOCo3O4抗体孵化物溶液，其特征在于，制备步骤如下: (1)Co3O4纳米片的制备 在磁力搅拌下，将2.(Γ3.0 g的CoC12*6H20溶于5(T70 mL超纯水中，制得CoCl2水溶液；将20 mL、0.Γ?.0 mol/L NaOH水溶液逐滴加入到CoCl2水溶液中，继续搅拌5 min，得到棕色沉淀，离心，用超纯水和无水乙醇分别洗涤3次，在60 °C真空干燥箱中干燥12 h，制得固体沉淀物，将其在30(T50(TC下煅烧I h，逐渐降到室温，制得Co3O4纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：任祥，杜斌，闫涛，魏琴，马洪敏，吴丹，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37