一种镍螯合型免疫复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种镍螯合型免疫复合物及其制备方法和应用，该镍螯合型免疫复合物为以下复合物中的一种：镍离子结合于免疫复合物形成的复合物，或镍离子结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；或镍离子结合于免疫球蛋白后与载体蛋白结合形成的复合物。本发明专利技术所述镍螯合型免疫复合物可用于检测地区人群血清中是否镍螯合型免疫复合物及含量，间接反映这个地区镍污染程度。

【技术实现步骤摘要】
一种镍螯合型免疫复合物及其制备方法和应用
本专利技术涉及属于医学领域，具体涉及镍螯合型免疫复合物及其制备方法和应用。
技术介绍
免疫复合物(Immunecomplexes，IC)是抗原抗体结合的产物，根据全国科学技术名词审定委员会的定义，是指抗体与可溶性抗原结合而形成的复合物。它分为两类，一种是组织中固定的免疫复合物，而另一种则是游离于血液中的免疫复合物，成为循环免疫复合物(circulatingimmunecomplexes，CIC)。免疫复合物在清除和破坏各种抗原中起着不可缺少的作用，机体免疫反应的结果就是不断产生免疫复合物。当机体内抗原(或抗体)数量略多于抗体(或抗原)时，就会形成中等分子大小的免疫复合物，它既不易被吞噬细胞吞噬，又不能通过肾小球滤孔排出，可较长时间游离于血液和其他体液中。当血管壁通透性增加时，此类IC可随血液沉积在某些部位的毛细血管壁或嵌合在肾小球基底膜上，激活补体导致免疫复合物沉积。这些沉积或镶嵌于血管壁或组织的免疫复合物，乃造成血管基膜炎症和组织损伤的始动因素。免疫复合物可通过以下几方面造成组织损伤：1)激活补体：沉积的IC通过激活补体，产生过敏毒素和具有趋化效应的活性片段，趋化至局部的肥大细胞、嗜碱性粒细胞释放活性介质致局部血管通透性增高，引起渗出和局部水肿；2)吸引白细胞浸润和集聚：中性粒细胞在吞噬IC时释放毒性氧化物和溶酶体酶，损伤邻近组织；3)活化血小板：IC可通过活化血小板释放血管活性胺类物质，导致血管扩张、通透性增加，加剧局部渗出和水肿，并激活凝血机制，形成微血栓，引起局部缺血、出血和组织坏死。多种疾病的发生都与免疫复合物的沉积息息相关，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、肾病综合征、冷球蛋白血症、脉管炎、细菌、病毒和寄生虫感染、过敏反应、自身免疫疾病、皮肤病等。早在上世纪90年代，就有学者发现，在正常机体中，免疫复合物被不断降解，因而一般检测不到免疫复合物或只呈现低浓度，而在上述一系列疾病中，血清中的免疫复合物即CIC含量显著升高。虽然CIC检测不具有疾病特异性，但其检测能提供关于免疫病理、疾病的发展及预后方面的信息。在某些微生物感染、自身免疫中，检测循环免疫复合物可用作疾病活动性、评价机体的机能和检测疗效的指标。而近些年来，学者们致力于研究特异性的免疫复合物，研究各种特异性免疫复合物与疾病致病、疾病发展、疾病诊断等各方面的关系，而这些研究将促使我们对疾病有更深一步了解。镍作为一种常见的有毒金属，广泛应用于生活、生产之中，包括生产硬币、珠宝、镍合金不锈钢、制造Ni-Cd电池等，与人们的生活息息相关。研究发现，过量的镍会导致机体多处组织及器官损伤，导致多种疾病的发生，包括呼吸系统疾病(肺炎、支气管炎、肺纤维化、哮喘、肺水肿等)、心血管疾病、肾脏疾病、皮肤疾病等，甚至还会导致肿瘤的发生。流行病学资料显示，长期接触镍的工人，其患呼吸系统肿瘤的几率大大增加，并且其因呼吸系统肿瘤致死的几率也大大增加。动物模型、体外模型试验也发现，镍可以诱导肿瘤的发生。1990年，国际癌症研究机构(InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)已将镍化合物作为第一类致癌物质(Group1)，将金属镍作为2B类致癌物质(Group2B)。可见，镍严重威胁人体的健康。关于镍导致人体损伤的机制尚不清楚，但是镍作为必需元素，与多种蛋白质作用关系紧密，相信镍与蛋白质之间的相互关系与镍致机体损伤息息相关，研究镍与蛋白质的关系将有助于我们了解镍致机体损伤的具体机制。镍与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。随着对镍毒性研究的深入，人们逐渐认识到镍与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重要的角色，被认为是了解镍的毒性机理的关键所在，因此，对镍和蛋白质相互作用的研究就显得愈发重要。而现在关于镍与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与镍之间的关系还不清楚，因而加强对于镍与蛋白质之间的关系至关重要。2004年美国学者A.Ramanaviciene等发现血清中循环免疫复合物含量与地方环境污染有关，发现随着地区污染严重程度的增加，当地牛血清中的CIC含量显著增加，差异具有统计学意义，因而可以作为评价地区污染的指标。但环境污染究竟是如何刺激机体内CIC含量显著升高，是一种还是多种污染物共同作用导致其升高，CIC的升高是否因此会导致机体损伤，增加机体对于疾病的易感性，这些都有待研究。众所周知，循环免疫复合物是一种特殊意义的蛋白质，而镍可作用于全身多个系统的蛋白质，镍是否可以作用于循环免疫复合物，而使循环免疫复合物含量改变、活性改变、功能改变，这些尚缺乏相关研究。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种镍螯合型免疫复合物，该镍螯合型免疫复合物可用于检测地区人群血清中是否存在镍螯合型免疫复合物及其含量，间接反映这个地区镍污染程度。为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种镍螯合型免疫复合物，该镍螯合型免疫复合物为以下复合物中的一种：镍离子结合于免疫复合物形成的复合物，或镍离子结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；或镍离子结合于免疫球蛋白后与载体蛋白结合形成的复合物。具体的，所述载体蛋白或免疫复合物至少含有锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中一种结构，镍离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中至少一种与载体蛋白或免疫复合物结合。具体的，所述载体蛋白为抗体蛋白、脂蛋白、血红蛋白、核抗原、异种血清抗原、病毒、细菌、原虫、蠕虫中的一种。进一步的，镍离子通过螯合剂与载体蛋白结合后再与能和载体蛋白特异性结合的抗体结合。进一步的，所述螯合剂为ITCBE、EDTA、多磷酸盐、氨基羧酸、1,3-二酮、羟基羧酸中的一种。本专利技术还提供了两种制备镍螯合型免疫复合物的方法，通过这两种方法获得镍螯合型免疫复合物。其中，第一种制备方法包括：A)合成镍螯合型免疫复合物的步骤：先将螯合剂与载体蛋白结合，再与镍离子络合；B)提纯镍螯合型免疫复合物的步骤：采用免疫亲和层析法去除步骤A)合成的镍螯合型免疫复合物中未参与反应的载体蛋白、特异性抗体及镍离子。具体地，所述镍螯合型免疫复合物的制备方法中，所述步骤A)具体步骤如下：(1)配制螯合剂：将螯合剂溶于溶剂中，配制成螯合剂溶液；(2)配制载体蛋白溶液：将载体蛋白加入到硼酸盐溶液中；(3)搅拌过夜：将步骤(1)螯合剂溶液加入到步骤(2)的载体蛋白溶液中，搅拌后于摇床中作用2-30h，得到混合液；(4)透析袋预处理：在透析袋中加入EDTA-NaHCO3溶液煮沸，弃废液后用ddH2O冲洗；重复该步骤1-3次；(5)透析：将步骤(3)的混合液装入经步骤(4)处理后的透析袋中，用ddH2O透析，换水2-3次，4℃透析过夜之后，收集液体；(6)镍离子螯合：在上述步骤(5)中的液体中加入HCl溶液调整pH至7.0，缓慢加入镍盐溶液，边滴加边振荡，之后于摇床中作用2-30h，然后重复步骤(5)一次，收集液体，得到镍螯合型抗原；(7)在上述镍螯合型抗原中加入能与载体蛋白特异性结合的抗体反应后得到镍螯合型免疫复合物；所述步骤B)具体步骤如下：(a)将上述A)步骤合成的镍螯合型免疫复合物复溶于生理盐水中，得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种镍螯合型免疫复合物，其特征在于，该镍螯合型免疫复合物为以下复合物中的一种：镍离子结合于免疫复合物形成的复合物，或镍离子结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；或镍离子结合于免疫球蛋白后与载体蛋白结合形成的复合物。

【技术特征摘要】
1.一种镍螯合型免疫复合物，其特征在于，该镍螯合型免疫复合物为镍离子结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；所述镍螯合型免疫复合物通过以下步骤制备而成：A）合成镍螯合型免疫复合物的步骤，具体如下：（1）配制螯合剂：将螯合剂溶于溶剂中，配制成螯合剂溶液；（2）配制载体蛋白溶液：将载体蛋白加入到硼酸盐溶液中，得到载体蛋白溶液；（3）搅拌过夜：将步骤（1）的螯合剂溶液加入到步骤（2）的载体蛋白溶液中，搅拌后于摇床中作用2-30h，得到混合液；（4）透析袋预处理：在透析袋中加入EDTA-NaHCO3溶液煮沸，弃废液后用ddH2O冲洗；重复该步骤1-3次；（5）透析：将步骤（3）的混合液装入经步骤（4）处理后的透析袋中，用ddH2O透析，换水2-3次，4℃透析过夜之后，收集液体；（6）镍离子螯合：在上述步骤（5）中的液体中加入HCl溶液调整pH至7.0，缓慢加入镍盐溶液，边滴加边振荡，之后于摇床中作用2-30h，然后将得到的液体装入经步骤（4）处理后的透析袋中，用ddH2O透析，换水2-3次，4℃透析过夜之后，收集液体，得到镍螯合型抗原；（7）在上述镍螯合型抗原中加入能与载体蛋白特异性结合的抗体反应后得到镍螯合型免疫复合物；B）提纯镍螯合型免疫复合物的步骤：采用免疫亲和层析法去除步骤A）合成的镍螯合型免疫复合物中未参与反应的载体蛋白、和该载体蛋白特异性结合的抗体及镍离子，具体如下：（a）将上述A）步骤合成的镍螯合型免疫复合物复溶于生理盐水中，得到镍螯合型免疫复合物溶液；（b）层析柱预处理：使用稀释缓冲液冲洗管路，在层析柱中装入能与免疫复合物特异性结合的填料，装柱后继续用稀释缓冲液平衡柱子；（c）上样：待柱子平衡后，用稀释缓冲液稀释上述（a）步骤得到的镍螯合型免疫复合物溶液，然后上柱，镍螯合型免疫复合物吸附在填料上，未反应的载体蛋白、抗体、镍离子随稀释缓冲液流出；（d）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗柱子，至基线平衡，然后使用0.05-0.10mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；（e）收集：收集步骤（d）中洗脱处理后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；（f）将经过步骤（e）收集到的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水2-4次后，多次4℃透析过夜，收集样本；（g）层析柱预处理：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与镍特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡柱子；（h）上样：待步骤（g）的柱子平衡后，用稀释缓冲液稀释上述步骤（f）的样本，然后将稀释后的样本上柱，镍螯合型免疫复合物吸附在填料上，未反应的抗原抗体复合物会随稀释缓冲液流出；（i）洗脱：步骤（h）之后用稀释缓冲液冲洗柱子，至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的Na2HPO4进行洗脱；（j）收集：收集步骤（i）洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；（k）将步骤（j）收集到的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得到纯化的镍螯合型免疫复合物。2.根据权利要求1所述的镍螯合型免疫复合物，其特征在于，所述载体蛋白至少含有锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中一种结构，镍离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中至少一种与载体蛋白结合。3.根据权利要求2所述的镍螯合型免疫复合物，其特征在于，所述载体蛋白为抗体蛋白、脂蛋白、血红蛋白、核抗原、异种血清抗原、病毒、细菌、原虫、蠕虫中的一种。4.一种如权利要求1所述的镍螯合型免疫复合物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：A）合成镍螯合型免疫复合物的步骤，具体如下：（1）配制螯合剂：将螯合剂溶于溶剂中...

【专利技术属性】
技术研发人员：张积仁，阳帆，董欣敏，吴婧，蔡睿，孙遥，赵乙木，
申请(专利权)人：上海拜豪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31