一种CK15角蛋白及基因的应用方法技术

一种CK15角蛋白及基因的应用方法，它基础于CK15角蛋白及基因在制备早期诊断尿路上皮移行细胞癌的产品中的应用，它的应用方法为：检测CK15角蛋白基因在人类尿路上皮移行细胞癌组织及其对应正常组织中的表达，总mRNA的抽提，使用Biometra公司的实时荧光定量PCR仪，实验数据用REST2009软件分析,P<0.05定义为有统计学意义，CK15角蛋白在人类尿路上皮移行细胞癌组织显著上调，它可以作为诊断尿路上皮移行细胞癌的特异标志，使尿路上皮移行细胞癌早期诊断，提高诊断的准确性及及术后动态监测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种CK15角蛋白及基因的应用方法，它基础于CK15角蛋白及基因在制备早期诊断尿路上皮移行细胞癌的产品中的应用，它的应用方法为：检测CK15角蛋白基因在人类尿路上皮移行细胞癌组织及其对应正常组织中的表达，总mRNA的抽提，使用Biometra公司的实时荧光定量PCR仪，实验数据用REST2009软件分析,P<0.05定义为有统计学意义，CK15角蛋白在人类尿路上皮移行细胞癌组织显著上调，它可以作为诊断尿路上皮移行细胞癌的特异标志，使尿路上皮移行细胞癌早期诊断，提高诊断的准确性及及术后动态监测。【专利说明】—种CK15角蛋白及基因的应用方法
本专利技术涉蛋白及基因
，具体涉及一种CK15角蛋白及基因在移行细胞癌早期诊断及术后快速动态监测的应用方法。
技术介绍
尿路上皮多器官癌是指肾盂、输尿管和膀胱等泌尿系统多个器官同时或先后发生移行细胞癌，尿路上皮移行细胞癌在泌尿系肿瘤中占有很重要的位置，是我国常见肿瘤之一。移行细胞癌发生率占尿路上皮肿瘤的90%以上。 尿路上皮移行细胞癌的典型生物学特征之一是多发性。这种多发性不仅表现为泌尿系同一器官同时或先后出现几个肿瘤，还表现为当尿路上皮系统的某个器官发生肿瘤，在泌尿系统的其他部位、同侧或对侧可同时或先后出现肿瘤。临床上尿路上皮多器官癌出现顺序多为顺尿流方向，且多见于解剖学上相邻的两个器官之间。泌尿系统各器官发生多器官癌的几率为:肾盂37.5%，输尿管75.0%，膀胱8.3%，尿道66.7%。以输尿管、尿道和肾盂的发生率较高。尿路上皮多器官癌还没有特异的诊断方法。目前临床对于该疾病的术前诊断主要有影像学检查、尿脱落细胞学检查、尿荧光原位杂交技术尿脱落细胞检测、输尿管镜检活检等，其中以尿脱落细胞学检查最为常用，传统的尿脱落细胞学检查诊断敏感性低。因此亟需出现新的方法以提高其早期诊断敏感性及术后复发的快速动态监测。 CK基因是上皮细胞中保持细胞结构的纤维蛋白家族。CK15基因也被称为KRT15;K15; KlCO0该基因的产物被称为CK15角蛋白，存在于多种器官的上皮细胞，包括部分食道、宫颈及角膜边缘细胞。人类的KRT15基因位于17q 21.2染色体区域，全长456氨基酸，分子大小49212 Da。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种CK15角蛋白基因的应用方法，它可以作为诊断尿路上皮移行细胞癌的特异标志基因，使尿路上皮移行细胞癌在早期即可快速诊断发现，、提高诊断的准确性及早期无创性诊断及术后动态监测。 为了解决
技术介绍
所存在的问题，本专利技术采用以下技术方案:所述的CK15角蛋白及基因在尿路上皮移行细胞癌的早期诊断，手术后期随访等试剂产品中的应用；所述用免疫检测诊断尿路上皮移行细胞癌的产品包括--与CK15蛋白特异性结合的抗体及非抗体类结合体，它的应用方法包括(A)、组织分离，手术切除待检的尿路上皮组织，分离后，迅速提取病灶及周围5cm以外正常组织，将待检样品组织块剪成适当大小印压于玻片上，用4%多聚甲醒固定5?10分钟，晾干；(B)、将制备好的样品置于2%BSA或10%BSA中，于37°C孵育湿盒内封闭30min；(C)、加入商业生产或自行制备的CK15蛋白的特异性抗体，用0.0lM pH7.4的PBS稀释进行1:100稀释，于37 °C孵育30 min过夜孵育，然后用0.0lM浓度的PBST漂洗5 minX3次； (D)、加荧光标记的CK15蛋白的二抗抗体，于37°C湿盒避光孵育30 1^11，再用0.0现的PBST避光漂洗5minX 3次，用甘油缓冲液封片并镜检，阳性结果为人类尿路上皮移行细胞癌。 所述的诊断尿路上皮移行细胞癌的产品包括:用CK15角蛋白免疫检测RT-PCR、实时定量PCR诊断尿路上皮移行细胞癌的产品，它的应用方法为(a)、组织分离，手术切除待检的尿路上皮组织，分离后，迅速提取病灶及周围5cm以外正常组织，放入液氮保存，逆转录酶为 M-MLV Reverse Transcriptase, Takara C0.PCR 试剂 TaqDNA 聚合酶、dNTP, CK15角蛋白基因的弓丨物是 Forward: 5，-ggaagagatccgggacaaa-3，Reverse: 5，-tgtcaatctccaggacaacg-3’，PCR产物长度为456 bp,以β-actin作为内参对照,其引物Forward: 5’-agccatgtacgtagccatcc-3’ Reverse:5’ - tcacaatgcctgtggtacg-3’，β-actin 扩增片断长度为 400bp ；(b)、总mRNA的抽提步骤具体如下:将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入ImlTRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理，将匀浆样品在室温放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离，每使用Iml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；4°C 1000Xg离心15分钟使样品分为三层:将上层无色水相转如离心管，用异丙醇沉淀水相中的RNA ;每使用Iml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟；用75 %乙醇洗涤RNA沉淀，每使用Iml TRIzol至少加Iml 75 %乙醇，2_8°C不超过7500Xg离心5分钟，弃上清；室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，加入25-200 μ I无Rnase水，55-60°C放置10分钟使RNA溶解；_70°C保存，为除去基因组DNA污染，全部RNA均用无RNA酶的DNA酶I消化；(c)、使用B1metra公司的实时荧光定量PCR仪，检测CK15角蛋白基因在人类尿路上皮移行细胞癌组织及其对应正常组织中的表达，反应体系如下:总体积20 μ 1，SYBR PremixEX Taq 10 μ 1，引物各0.2 μ 1，DNA I μ 1，ddH20 8.2 μ 1，离心混匀，放入PCR仪中反应，以β -actin为内参，实验数据用REST2009软件分析，P〈0.05定义为有统计学意义，CK15角蛋白在人类尿路上皮移行细胞癌组织显著上调；本专利技术具有以下有益效果:它可以作为诊断尿路上皮移行细胞癌的特异标志基因，用于尿路上皮移行细胞癌的诊断，提高诊断的准确性及早期无创性诊断及术后动态监测。 【具体实施方式】:本【具体实施方式】采取以下技术方案:所述的CK15角蛋白及基因在尿路上皮移行细胞癌的早期诊断，手术后期随访等试剂产品中的应用；所述用免疫检测诊断尿路上皮移行细胞癌的产品包括:与CK15蛋白特异性结合的抗体及非抗体类结合体，它的应用方法包括(A)、组织分离，手术切除待检的尿路上皮组织，分离后，迅速提取病灶及周围5cm以外正常组织，将待检样品组织块剪成适当大小印压于玻片上，用4%多聚甲醛固定5?10分钟，晾干;(B)、将制备好的样品置于2%BSA或10%BSA中，于37°C孵育湿盒内封闭30min；(C)、加入商业生产或自行制备的CK15蛋白的特异性抗体，用0.0lM pH7.4的PBS稀释进行1:100稀释，于37 °C孵育30 min过夜孵育，然后用0.0lM浓度的PBST漂洗5 min X 3次；(D)、加荧光标记的CK15蛋白的二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CK15角蛋白及基因的应用方法，其特征在于所述的CK15角蛋白及基因在尿路上皮移行细胞癌的早期诊断,手术后期随访等试剂产品中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：太光平，赵三军，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53