【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及植物遗传转化筛选体系的建构方法及应用。
技术介绍
1、现行的植物基因工程一般通过农杆菌介导侵染宿主植物的愈伤组织，通过农杆菌的t-dna介导将外源基因序列转化、并随机插入到植物细胞中基因组中。因常规转基因方法构建的转基因细胞效率较低，需要通过一定的筛选方法对阳性细胞进行筛选，目前常用筛选方法为抗生素筛选和除草剂筛选。它们的有用性可以说是明确的，但除草剂和抗生素的使用和释放对环境带来污染，或者是转化周期较长，它们的抗性基因出现逃逸事件以及存在生物安全性等问题。因此，迫切需要寻找一种能够在植物转基因系统中，转化周期短、生物安全性更高的新筛选方法。
技术实现思路
1、为了克服上述技术缺陷的不足，本专利技术提供一种植物遗传转化筛选体系的建构方法，可以提高植物遗传转化的效率，并且相较于抗生素筛选方法更加安全。
2、为实现上述目的，本专利技术通过以下方案实现予以实现：
3、通过研究发现，亚硫酸盐还原酶（sir）可以将亚硫酸盐还原为硫化物；另外，亚硫酸盐氧化酶（sox），可以将因外界因素（空气污染或胁迫诱导）而积累的亚硫酸盐氧化为硫酸盐。这两种代谢酶不仅能保护植物免受毒性水平的亚硫酸盐的侵害，能将亚硫酸盐转化成植物生长和发育所必需的元素硫（s），促进转基因植物的生长，或许还可以发挥除草作用用于转基因作物种植时的杂草控制。
4、专利技术人将这两种亚硫酸盐代谢酶基因在植物中进行过表达，赋予植物对亚硫酸盐足够的解毒能力，在亚硫酸盐选择压力
5、因此，第一方面本专利技术提供植物遗传转化筛选体系的建构方法，包括以下步骤：
6、s1.构建含有亚硫酸盐代谢酶基因的载体；
7、s2.将载体转化进农杆菌，得到农杆菌工程菌；
8、s3.将植物组织接种到不同浓度的na2so3的选择培养基中培养统计存活率，得到na2so3胁迫下植物组织的最大耐受范围；
9、s4.使用含有亚硫酸盐代谢酶基因的农杆菌工程菌液对植物组织进行侵染转化，得到植物愈伤组织；
10、s5.将植物愈伤组织置于共培养基中进行共培养，共培养后转置于选择培养基中进行转化子的选择培养；
11、s6.对转化愈伤组织的报告基因进行瞬时表达检测和再生植株的pcr检测；完成植物遗传转化筛选体系的建构。
12、本专利技术利用亚硫酸盐代谢酶作为选择标记基因，选用亚硫酸钠（na2so3）作为植物转化的胁迫筛选剂，建立以na2so3/sir、na2so3/sox为基础的植物遗传转化筛选体系，当培养植物细胞添加亚硫酸盐时，选择基因编码的亚硫酸盐代谢酶被过表达，可将亚硫酸盐转化为植物可吸收的硫化物或者硫酸盐，未转化细胞内源基因表达则不足以代谢掉毒性水平的亚硫酸盐而死亡，从而筛选出阳性转基因植株。
13、进一步地，所述s1中亚硫酸盐代谢酶可以为亚硫酸盐还原酶、亚硫酸盐氧化酶中的一种。
14、一些具体的实施例中，作为选择标记基因的亚硫酸盐还原酶（atsir）、亚硫酸盐氧化酶（atsox）的基因提取于拟南芥。
15、进一步地，所述s1中亚硫酸盐代谢酶基因的核苷酸序列为如下（a）、（b）或（c）：
16、（a）如seqidno.1所示的核苷酸序列；
17、（b）与seq id no. 1所示的核苷酸序列杂交且编码的核苷酸序列；
18、（c）与seq id no. 1所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且编码的核苷酸序列。
19、进一步地，所述s1中亚硫酸盐代谢酶基因的核苷酸序列为如下（a）、（b）或（c）：
20、（a）如seqidno.2所示的核苷酸序列；
21、（b）与seq id no. 2所示的核苷酸序列杂交且编码的核苷酸序列；
22、（c）与seq id no. 2所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且编码的核苷酸序列。
23、一些具体的实施例中，亚硫酸盐代谢酶基因与seq id no. 1或seq id no. 2所示序列具有80％同一性；优选的具有85％同一性，更优选的具有90％同一性，更优选的具有95％同一性，最优选的，具有99％同一性。
24、进一步地，所述s1中载体采用以下步骤制备：使用 xbai和 xhoi对pbi质粒进行双酶切，酶切后载体进行纯化，获得酶切载体；将酶切载体与连接片段加入到连接体系，进行连接；将连接完成的连接载体转入感受态大肠杆菌dh5α进行转化，经亚硫酸盐代谢酶筛选，挑取阳性质粒。
25、进一步地，所述s2中农杆菌工程菌采用以下步骤制备：将eha105农杆菌感受态细胞解冻后，加入含有亚硫酸盐代谢酶基因的载体，通过电激法转化感受态细胞；于黑暗条件下培养活化。
26、进一步地，所述s5中筛选培养是在添加na2so3作为筛选剂的ms培养基中进行转化子的筛选培养，选择培养基中na2so3浓度≤经s3确定的植物组织临界致死浓度。
27、进一步地，所述s5中选择培养基为含有8-12mm na2so3的ms培养基。
28、进一步地，所述s5中共培养时间为3天，选择培养时间为60-65天，直至获得抗性愈伤组织和再生植株。
29、第二方面，本专利技术提供一种如上述建构方法得到的植物遗传转化筛选体系。
30、进一步地，植物遗传转化筛选体系的选择标记基因为亚硫酸盐代谢酶基因。
31、一些具体的实施例中，亚硫酸盐代谢酶基因可以为亚硫酸盐还原酶、亚硫酸盐氧化酶中的一种。
32、第三方面，本专利技术提供植物遗传转化筛选体系在转基因植物阳性筛选的应用。
33、与现有技术相比，本专利技术所构建的植物遗传转化筛选体系，具有以下有益效果：
34、（1）以亚硫酸盐代谢酶作为选择标记基因，以亚硫酸钠作为植物转化的胁迫筛选剂，从而筛选出阳性转基因植株，明显缩短植物遗传转化需要的时间；
35、（2）亚硫酸钠筛选相对卡那霉素等抗生素筛选对植物细胞影响较小，毒害作用较轻；
36、（3）转基因植株对亚硫酸盐足够的解毒能力，将有毒化合物转化为植物能够利用且有价值的化合物；
37、（4）亚硫酸盐作为转基因植株硫营养元素的额外来源，为转基因植株提供营养，后续还可以发挥除草作用用于转基因作物种植时的杂草控制。
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1.植物遗传转化筛选体系的建构方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的植物遗传转化筛选体系的建构方法，其特征在于，所述S1中亚硫酸盐代谢酶选自亚硫酸盐还原酶、亚硫酸盐氧化酶中的一种。
3.根据权利要求1-2任一项所述的植物遗传转化筛选体系的建构方法，其特征在于，所述S1中载体采用以下步骤制备：使用XbaI和XhoI对pBI质粒进行双酶切，酶切后载体进行纯化，获得酶切载体；将酶切载体与连接片段加入到连接体系，进行连接；将连接完成的连接载体转入感受态大肠杆菌DH5α进行转化，经亚硫酸盐代谢酶筛选，挑取阳性质粒。
4.根据权利要求1-2任一项所述的植物遗传转化筛选体系的建构方法，其特征在于，所述S2中农杆菌工程菌采用以下步骤制备：将EHA105农杆菌感受态细胞解冻后，加入含有亚硫酸盐代谢酶基因的载体，通过电激法转化感受态细胞；于黑暗条件下培养活化。
5.根据权利要求1-2任一项所述的植物遗传转化筛选体系的建构方法，其特征在于，所述S5中筛选培养是在添加Na2SO3作为筛选剂的MS培养基中进行转化子的筛选培养，选择培养基中N
6.根据权利要求1-2任一项所述的植物遗传转化筛选体系的建构方法，其特征在于，所述S5中选择培养基为含有8-12mM Na2SO3的MS培养基。
7.根据权利要求1-2任一项所述的植物遗传转化筛选体系的建构方法，其特征在于，其特征在于，所述S5中共培养时间为3天，选择培养时间为60-65天，直至获得抗性愈伤组织和再生植株。
8.根据权利要求1-7任一项所述的建构方法得到的植物遗传转化筛选体系。
9.根据权利要求8所述的筛选体系在转基因植物阳性筛选的应用。
...【技术特征摘要】
1.植物遗传转化筛选体系的建构方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的植物遗传转化筛选体系的建构方法，其特征在于，所述s1中亚硫酸盐代谢酶选自亚硫酸盐还原酶、亚硫酸盐氧化酶中的一种。
3.根据权利要求1-2任一项所述的植物遗传转化筛选体系的建构方法，其特征在于，所述s1中载体采用以下步骤制备：使用xbai和xhoi对pbi质粒进行双酶切，酶切后载体进行纯化，获得酶切载体；将酶切载体与连接片段加入到连接体系，进行连接；将连接完成的连接载体转入感受态大肠杆菌dh5α进行转化，经亚硫酸盐代谢酶筛选，挑取阳性质粒。
4.根据权利要求1-2任一项所述的植物遗传转化筛选体系的建构方法，其特征在于，所述s2中农杆菌工程菌采用以下步骤制备：将eha105农杆菌感受态细胞解冻后，加入含有亚硫酸盐代谢酶基因的载体，通过电激法转化感受态...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄艳容，邹竹荣，胡迪，寸蓝瑞，姚雪琛，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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