【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因表达调控，具体涉及一种低温下农药诱导基因表达的方法。
技术介绍
1、本专利技术是申请人之前开发的农药诱导细菌基因表达技术（专利公开号cn113234746a）的改进和在低温下应用的拓展。其中使用的农药是双炔酰菌胺（mandipropamid），一种专门针对卵菌的低毒高效农药。双炔酰菌胺是先正达公司注册的农药制剂“瑞凡（revus）”的主要成分。农药诱导细菌基因表达技术（简称mandi-t7）是两个技术的组合。第一个技术是改造过的植物激素脱落酸（aba）共受体蛋白pyr1mandi和abi，能够产生依赖于农药双炔酰菌胺的蛋白相互作用，而不再对aba敏感[1,2]。申请人已公开的专利（cn113234746a）对abi蛋白进行了环式重排（以下称为abi-cp），abi新的氨基端靠近pyr1mandi蛋白的羧基末端，距离缩小到约24埃，空间上位于abi-cp蛋白同侧，这样pyr1mandi和abi更适于作为融合蛋白使其它蛋白空间邻近。第二个技术是t7 rna聚合酶双片段互补，即t7 rna聚合酶在某些位点被拆分、改造为两段，t7n和t7c分别表达，这两段自身不会自发重组为有功能的t7 rna 聚合酶；当t7n和t7c分别融合的蛋白可以互作，则t7n和t7c有可能被拉近，互补为有功能的 t7 rna聚合酶[3]。该技术可以将蛋白互作事件以t7 rna聚合酶重组后驱动目的基因表达的方式输出[3]。将这两种技术组合起来，pyr1mandi和t7n融合表达，abi-cp和t7c融合表达，农药双炔酰菌胺诱导pyr1mandi和
2、参考文献：
3、[1], park, sy, peterson, et al. agrochemical control of plant wateruse using engineered abscisic acid receptors. nature, (2015) 520: 545–548.
4、[2], ziegler, mj, yserentant, k, et al. a chemical strategy tocontrol protein networks in vivo. biorxiv 2020.04.08.031427; doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.08.031427
5、[3], pu j , zinkus-boltz j , dickinson b c . evolution of a split rnapolymerase as a versatile biosensor platform. nature chemical biology, 2017,13(4):432-438.
6、[4], pu j, kentala k, dickinson bc. multidimensional control of cas9by evolved rna polymerase-based biosensors. acs chemical biology, 2018, 13(2):431-437. doi: 10.1021/acschembio.7b00532.
7、[5], segall-shapiro th, meyer aj, ellington ad, sontag ed, voigt ca.a 'resource allocator' for transcription based on a highly fragmented t7 rnapolymerase. mol syst biol. 2014 jul 30;10(7):742. doi: 10.15252/msb.20145299.
8、[6], han t, chen q, liu h. engineered photoactivatable geneticswitches based on the bacterium phage t7 rna polymerase. acs synth biol. 2017feb 17;6(2):357-366. doi: 10.1021/acssynbio.6b00248。
技术实现思路
1、解决的技术问题：
2、本申请针对现有技术的不足，本申请解决现有诱导表达系统的不能在23摄氏度工作的局限性，提供一种在低温下利用双炔酰菌胺调控基因表达的方法，开发了可本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于，所述农药为双炔酰菌胺，所述诱导基因表达为诱导mcherry在大肠杆菌或根癌农杆菌中23℃下表达；其中双炔酰菌胺诱导mcherry 在大肠杆菌中23℃下表达，具体包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于：所述步骤1中大肠杆菌Top10菌株不能使用带有内源T7 RNA聚合酶的菌株。
3.根据权利要求2所述低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于：所述带有内源T7RNA聚合酶的菌株为BL21(DE3)菌株。
4.根据权利要求1所述低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于：所述步骤2中检测目标基因表达效果用以下参数，激发光587nm，发射光610nm检测报告基因mcherry的荧光强度。
5.根据权利要求1所述低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于：质粒1构建，含有两个表达盒，在大肠杆菌中在109位点T7RNA 聚合酶拆分成为eT7N和T7-RNAPc；T7-RNAPc和PYR1MANDI融合表达，eT7N与ABI-CP234融合表达；两个表达盒的终止
6.根据权利要求1所述低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于：质粒2表达盒含有启动子PT7驱动目标基因mcherry表达，所述PT7序列如SEQ ID NO.8所示，mcherry序列如SEQ ID NO.9所示。
7.根据权利要求1所述低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于，所述双炔酰菌胺诱导mcherry在根癌农杆菌中在23℃下表达，具体包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于：质粒3序列如SEQID NO.3所示，质粒3包含3个表达盒，分割的T7 RNA聚合酶片段T7-RNAPc和PYR1MANDI融合表达，eT7N与ABI-CP234融合表达，以及启动子PT7驱动目标基因mcherry表达；其中T7-RNAPc和PYR1MANDI融合表达、eT7N与ABI-CP234融合表达两个表达盒的终止原件分别为T7 ter 和ilvBN；eT7N序列如SEQ ID NO.4所示，T7 ter序列如SEQ ID NO.11所示，ilvBN序列如SEQID NO.12所示； ABI-CP234序列如SEQ ID NO.5所示，PYR1MANDI序列如SEQ ID NO.6所示，T7-RNAPc序列如SEQ ID NO.7所示；所述PT7序列如SEQ ID NO.8所示，mcherry序列如SEQ IDNO.9所示，质粒3还含有在根癌农杆菌中维持质粒复制的复制子pVS1，所述pVS1序列如SEQID NO.10所示。
...【技术特征摘要】
1.一种低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于，所述农药为双炔酰菌胺，所述诱导基因表达为诱导mcherry在大肠杆菌或根癌农杆菌中23℃下表达；其中双炔酰菌胺诱导mcherry 在大肠杆菌中23℃下表达，具体包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于：所述步骤1中大肠杆菌top10菌株不能使用带有内源t7 rna聚合酶的菌株。
3.根据权利要求2所述低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于：所述带有内源t7rna聚合酶的菌株为bl21(de3)菌株。
4.根据权利要求1所述低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于：所述步骤2中检测目标基因表达效果用以下参数，激发光587nm，发射光610nm检测报告基因mcherry的荧光强度。
5.根据权利要求1所述低温下农药诱导基因表达的方法，其特征在于：质粒1构建，含有两个表达盒，在大肠杆菌中在109位点t7rna 聚合酶拆分成为et7n和t7-rnapc；t7-rnapc和pyr1mandi融合表达，et7n与abi-cp234融合表达；两个表达盒的终止原件分别为t7 ter 和ilvbn，其中et7n序列如seq id no.4所示，abi-cp234序列如seq id no.5所示，pyr1mandi序列如seq id no.6所示， t7-rnapc序列如seq id no.7所示；两个终止原件中t7 ter序列如seq id no.11所示，ilvbn序列如seq id ...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。