本发明专利技术涉及用于检测分离的样品中的抗苍白密螺旋体的TpN17抗原的抗体的方法，其中用霍乱弧菌脂蛋白15(VcLp15)的肽序列或其部分序列作为用于减少干扰(即用于最少化假阳性结果)的试剂。此外，本发明专利技术涉及包含VcLp15肽序列和分子伴侣的融合多肽，它们在免疫测定中作为用于减少干扰和用于最少化假阳性结果的添加剂的用途，及包含TpN17抗原和该VcLp15分子伴侣融合多肽的用于检测分离的样品中的抗苍白密螺旋体抗原的抗体的试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
VcLp15变体在基于TpN17的检测抗密螺旋体抗体的免疫测 定中作为抗干扰添加剂
本专利技术涉及用于检测分离的样品中的抗苍白密螺旋体（Treponema pallidum)的 TpN17抗原的抗体的方法，其中用霍乱弧菌脂蛋白15(VcLpl5)的肽序列作为用于减少干扰 和用于最少化假阳性结果的试剂。此外，本专利技术涉及包含VcLpl5肽序列和分子伴侣的融合 多肽，它们在免疫测定中作为用于减少干扰和用于最少化假阳性结果的添加剂的用途，及 包含TpN17抗原和该VcLpl5分子伴侣融合多肽的用于检测分离的样品中的抗苍白密螺旋 体抗原的抗体的试剂盒。
技术介绍
梅毒（Syphilis，又名Lues)是由隶属于螺旋体细菌家族的苍白密螺旋体引起的 严重感染性疾病。它主要通过性接触传播，但也可以在妊娠期间从孕妇传至胎儿。该疾病 表征为不同的临床阶段和长的潜伏、无症状感染期。许多感染个体未注意到症状，因此多年 未意识到其梅毒感染。初次感染有限，且通常引起小的无痛溃疡（第一阶段，梅毒I (Lues I)）。如果不进行青霉素治疗，则该疾病进展至第二阶段梅毒II (Lues II)(感染后约8 周），其产生流感样症状、非发痒性皮疹和肿胀淋巴结。几年后，在梅毒IlKLues III)阶 段，全身出现梅毒结节（syphilitic node)。最后的阶段（梅毒IV(Lues IV))表征为中枢 神经系统的破坏，最终导致神经和心脏障碍、全身麻搏（general paralysis)、共济失调、痴 呆和失明。 虽然由于在20世纪中叶引入了青霉素而有有效的疗法可用，但梅毒仍是重要的 全球性健康问题，估计全世界每年有一千二百万例新的感染。必须可靠地鉴别密螺旋体感 染患者，以起始抗生素疗法，从而预防梅毒的进一步传播。因此，有必要提供可靠的诊断工 具（如免疫测定）来检测抗苍白密螺旋体的抗体。但是，为了在血清学应用中用作特异性 化合物，重组衍生的蛋白质必须满足几点要求，如溶解性、稳定性和抗原性。 TpN17(苍白密螺旋体菌株Nichols，17KDa)(其成熟形式是由134个氨基酸残基组 成的小蛋白质）是苍白密螺旋体（梅毒的病原体）的免疫显性抗原（1(：1111.1^1^11111111111〇1· (1998)，50, 27-44 ;Folia Microbial. (2003)48(4)，549-553)。抗 TpN17 的抗体在密螺旋体 感染的个体中常见且丰富，有必要在旨在敏感和可靠地检测密螺旋体感染的免疫测定中使 用 TpN17。 但是，我们观察到，用TpN17作为抗原的免疫测定倾向于显示假阳性结果，即它提 供表面看来为阳性的信号，但实际上样品中不存在抗密螺旋体的抗体。这些干扰是罕见但 显著的现象。它们损害了免疫测定的特异性，且它们显然是由梅毒免疫测定中实际上不可 或缺的苍白密螺旋体抗原TpN17的使用引起。 因此，本专利技术潜在的问题可以视为提供用于检测抗密螺旋体抗体时避免假阳性结 果和提高基于TpN17的免疫测定的特异性的工具和方法。 专利技术概述 通过权利要求所表征的本专利技术来解决该问题。具体而言，本专利技术涉及用于检 测分离的样品中抗苍白密螺旋体的TpN 17抗原的抗体的方法，其中用霍乱弧菌脂蛋白 15 (VcLpl5)的肽序列或其部分序列作为用于减少干扰，即用于最少化假阳性结果的试剂。 该VcLpl5多肽序列的部分序列可以包含SEQ ID NO. 1的氨基酸26-163。在另一实施方案 中，该VcLpl5肽序列或其部分序列与分子伴侣融合。 本专利技术还涉及包含SEQ ID NO. 1的VcLpl5肽序列或其部分序列和分子伴侣的融 合多肽。在优选实施方案中，与VcLpl5肽序列融合的分子伴侣选自SlyD、SlpA、FkpA和 Skp〇 在另一优选实施方案中，该融合多肽包含SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 3是大肠杆菌 (E. coli) SlyD 和 VcLpl5 的融合多肽（EcSlyD-VcLpl5)。 本专利技术还涵盖包含VcLpl5肽和可选的分子伴侣的融合多肽作为添加剂在免疫测 定中减少干扰和最少化假阳性结果中的用途。 在另一实施方案中，本专利技术涉及用于通过免疫测定检测分离的样品中抗苍白密螺 旋体抗原的抗体的试剂盒，其包含TpN17抗原、及含有VcLpl5肽和可选的分子伴侣的融合 多肽。 本专利技术还涉及用于检测分离的样品中抗苍白密螺旋体的TpN17抗原的抗体的方 法，该方法包括 ： a)通过将体液样品与存在于该样品中的该抗体可以特异性结合的特异性结合配 偶体混合来形成免疫反应混合物； b)在向该样品加入该特异性结合配偶体之前、同时或之后向该免疫反应混合物加 入包含VcLpl5肽和可选的分子伴侣的融合多肽； c)维持该免疫反应混合物足以使存在于该体液样品中的抗体与该特异性结合配 偶体进行免疫反应，以形成免疫反应产物的时期；和 d)检测该免疫反应产物中的任一种的存在和/或浓度。 附图、附表和SEQ ID N0简述 图1显示本专利技术的融合多肽EcSlyD-VcLpl5的近UV⑶光谱（紫外圆二色谱）；更 多细节见实施例4,实施例4描述通过⑶光谱监测的热诱导的EcSlyD-VcLpl5的解折叠。 图2显示通过近UV区中的⑶光谱监测的本专利技术的融合多肽EcSlyD-VcLpl5的熔 解曲线。细节见实施例4。 图3显示具有与它的N端符合读框地融合的两个SlyD分子伴侣单位的密螺旋体TpN17 全长抗原23-156的示意图。为了表示该SlyD融合配偶体的大肠杆菌来源，将所示融合多 肽命名为 EcSlyD-EcSlyD-TpN17(23-156);还见 SEQ ID N0.8。 表1显示用于本研究（实施例2)的融合多肽变体的蛋白质参数。 表2至5显示按照实施例5对霍乱弧菌Lpl5在梅毒免疫测定中的抗干扰活性进 行的实验的结果。 表2显示寡聚TpN17作为密螺旋体特异性抗原的结果，其中加入单体VcLpl5(与 作为分子伴侣的SlyD融合）来减少干扰。 表3显示单体TpN17作为密螺旋体特异性抗原的结果，其中加入单体VcLpl5(与 作为分子伴侣的SlyD融合）来减少干扰。 表4显示寡聚TpN17作为密螺旋体特异性抗原的结果，其中加入寡聚VcLpl5(与 作为分子伴侣的Skp融合）来减少干扰。 表5显示单体TpN17作为密螺旋体特异性抗原的结果，其中加入寡聚VcLpl5(与 作为分子伴侣的Skp融合）来减少干扰。 SEQ ID NO. 1显示可从公共数据库UniProt检索号Q9KQN6检索到的霍乱弧菌脂 蛋白15 (VcLpl5)的完整氨基酸序列（163个残基）。氨基酸残基1-25组成信号序列；成熟 VcLpl5包含氨基酸残基26-163 (下划线）。 MMKKSIFALS ALTLILVGCD NQQDAKVEVE KVVDVAAAPA EQSAAQPSTA SVDAAHNAQN SLDffAGIYQG TLPCADCGGI ETELTLNADG TYALTEKYLD KEGEPFASQG TFV本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测分离的样品中抗苍白密螺旋体的TpN17抗原的抗体的方法，其中用霍乱弧菌脂蛋白15(VcLp15)的肽序列作为用于减少干扰和用于最少化假阳性结果的试剂。
【技术特征摘要】
2013.07.18 EP 13003633.81. 用于检测分离的样品中抗苍白密螺旋体的TpN17抗原的抗体的方法，其中用霍乱弧 菌脂蛋白15 (VcLpl5)的肽序列作为用于减少干扰和用于最少化假阳性结果的试剂。2. 权利要求 1 的方法，其中使用 UniProt ID Q9KQN6(SEQ ID NO. 1)或 SEQ ID NO. 2、 或SEQ ID NO. 1或2的部分序列的肽序列。3. 权利要求2的方法，其中VcLpl5的部分序列包含SEQ ID NO. 1或2的氨基酸26-163。4. 权利要求1至3中任一项的方法，其中VcLpl5肽序列或其部分序列与分子伴侣融 合。5. 融合多肽，其包含SEQ ID NO. 1或2的VcLpl5肽序列或SEQ ID NO. 1或2的部分序 列和分子伴侣。6. 权利要求5的融合多肽，其中分子伴侣选自SlyD、SlpA、FkpA和Skp。7. 权利要求5或6的融合多肽，其包含SEQ ID NO. 3。8. 权利要求5至7的融合多肽作为免疫测定中的添加剂的用途，用于减少干扰和用于 最少化假阳性结果。9. 用于通过免疫测定检测分离的样品中抗苍白密螺旋体抗原的抗体的试剂盒，其包含 TpN17抗原和权...
【专利技术属性】
技术研发人员：E·法特兹，P·沙尔施密特，U·施密特，C·舒尔茨，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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