本发明专利技术公开了一种小鼠抗人PRRT2单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。PRRT2是新发现的基因，该基因突变可导致发作性运动诱发性运动障碍(paroxysmalkinesigenicdyskinesia,PKD)。本发明专利技术提供了一种抗人PRRT2单克隆抗体，其对应的抗原表位的序列如SEQIDNO3-SEQIDNO8中的任意一条所示。本发明专利技术所制备的抗体具有高度特异性和敏感性，为进一步研究PRRT2在PKD发病中的作用提供了工具，具有重要应用前景。本发明专利技术还涉及上述抗人PRRT2单克隆抗体的制备方法和应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及PRRT2抗体的制备和应用。具体的说，本专利技术提供了一种小鼠抗人PRRT2蛋白的单克隆抗体、及其制备方法和应用。
技术介绍
发作性运动诱发性运动障碍是（paroxysmal kinesigenic dyskinesia, PKD） 是一种反复发作、运动诱发、持续时间短暂的运动障碍，呈常染色体显性遗传，表现为舞蹈症、手足徐动、投掷症、肌张力障碍等不自主运动。2011年，本申请的专利技术人在国际上首次发现PRRT2是家族性PKD的致病基因。 人PRRT2位于16p11.2，有4个外显子，编码含340个氨基酸的富含脯氨酸跨膜蛋白2(proline-rich transmembrane protein 2, PRRT2)。PRRT2蛋白属于CD225家族，其靠近C端有2个跨膜结构域。 目前，几种商品化的PRRT2抗体均为多克隆抗体，特异性差，应用Western blot和免疫荧光的方法，该抗体检测结果显示明显的非特异性，从而对人PRRT2表达谱研究和功能研究受到限制。因此，制备特异性较好的小鼠抗人PRRT2单克隆抗体，并应用于表达谱分析及在PKD发病中的作用具有实际作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异性好的抗PRRT2蛋白的单克隆抗体。 本专利技术的另一个目的是提供上述抗PRRT2蛋白的单克隆抗体的制备方法。 本专利技术从PRRT2蛋白序列中设计串联的多肽抗原表位，进行抗原合成，进而制备筛选出PRRT2单克隆抗体，并进行应用。 本专利技术抗原表位设计采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计程序。通过计算如下参数来确定表面肽：溶剂可接近性、无序指数、蛋白-蛋白相互作用的结构域预测、或以上任意组合。选择长度为10个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区以及位于无序区域的肽作为抗原表位。为了避免不同肽片段之间产生新的抗原表位，在不同肽片段之间插入一个弱免疫原性接头GGGGS将所述肽片段串联到一起。通过全基因组化学合成的方法合成抗原表位对应的目的cDNA序列，重组到表达载体，诱导表达免疫原，纯化后多点免疫小鼠。经过了3年多时间、数以千次的试验，最终得到本专利技术的抗体。 本专利技术提供了一种抗人PRRT2单克隆抗体，其对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条所示。较好的，其对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 6 或者 SEQ ID NO 7所示。本专利技术提供了一种小鼠抗人PRRT2单克隆抗体，其制备方法是从PRRT2蛋白序列中选择数个肽片段作为抗原表位，通过接头将不同肽片段串联到一起；合成抗原表位对应的目的cDNA序列，诱导表达串联多肽免疫原；任选组合佐剂联合所述免疫原多点免疫小鼠，经细胞融合和筛选获得单克隆抗体。 在本专利技术的一个优选例中，对所获得的抗人PRRT2单克隆抗体进行了保藏。相关产生抗人PRRT2单克隆抗体的杂交瘤细胞，是分泌PRRT2抗体的小鼠骨髓瘤融合细胞株9293-1hz-3P2，保藏号为CGMCC No.7810。CGMCC即中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年7月9日。 本专利技术的抗人PRRT2单克隆抗体，能够特异性识别PRRT2蛋白。 本专利技术还提供了上述抗人PRRT2单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤： （1） 从PRRT2蛋白序列中选择1-6个肽片段作为抗原表位，通过接头将不同肽片段串联到一起；所述的抗原表位的序列选自SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条或者若干条；（2） 合成抗原表位对应的目的cDNA序列，诱导表达串联多肽免疫原；（3） 佐剂联合所述免疫原多点免疫小鼠，经细胞融合和筛选获得单克隆抗体。其中所述选择数个肽片段作为抗原表位，通常选2-10个，本专利技术选择6个 肽片段。 其中，所述的肽片段是长度为10个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区并且位于无序区域的肽。 在本专利技术的一个实施例中，所述的串联多肽免疫原的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。 所述肽片段可以采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计程序获得，然后通过实验检测验证。 所述接头最好具有弱免疫原性。例如，在本专利技术的优选例中，采用的是GGGGS。制备单抗串联多肽原是5个GGGGS将选择6个抗原表位肽片段串联在一起的肽段。 抗原表位cDNA可以通过本领域常规基因工程技术手段获得，或者采用全基因组化学合成的方法获得。 串联多肽原的表达是通过将串联多肽原的cDNA重组到PET32a表达质粒，转化Rosetta感受态细胞，诱导表达获得。 本专利技术的方法中，免疫过程中所使用的佐剂选自：弗氏完全佐剂、铝、CpG、或其任意组合。 其中，所述多位点免疫在选自以下位点的、至少2个位点进行：颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟、前腿腋窝、后腿肌肉。 其中，所述细胞融合是将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（例如，SP2/0）进行融合。 其中所述筛选是对融合的杂交瘤细胞进行筛选。杂交瘤的筛选是通过有限稀释法亚克隆和ELISA检测。所述抗体通过Western blot 和细胞免疫荧光进行特异性验证。 在本专利技术的一个优选例中，所产生的单克隆抗体所对应的抗原表位是：PSSQLAGPGV。 本专利技术的小鼠抗人PRRT2单克隆抗体的提取方法具体如下： 1. 人PRRT2免疫抗原设计人PRRT2蛋白全长氨基酸序列为：（SEQ ID NO 1）1 maassseise mkgveespkv pgegpghsea etgppqvlag vpdqpeapqp gpnttaapvd 61 sgpkaglape ttetpagase taqatdlsls pggeskancs pedpcqetvs kpevskeata 121 dqgsrlesaa ppepapepap qpdprpdsqp tpkpalqpel ptqedptpei lsesvgekqe 181 ngavvplqag dgeegpapep hsppskkspp angapprvlq qlveedrmrr ahsghpgspr 241 gslsrhpssq lagpgvegge gtqkprdyii lailscfcpm wpvnivafay avmsrnslqq 301 gdvdgaqrlg rvakllsiva lvggvliiia scvinlgvyk采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计软件从目标蛋白PRRT2的aa序列中挑选6条长度为10aa的肽段（见表1），肽段与肽段之间用GGGGS肽段连接。最终确定PR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗人PRRT2单克隆抗体，其特征在于，所述的抗人PRRT2单克隆抗体对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 3‑ SEQ ID NO 8中的任意一条所示。
【技术特征摘要】
1.一种抗人PRRT2单克隆抗体，其特征在于，所述的抗人PRRT2单克隆抗体对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条所示。
2.如权利要求1所述的抗人PRRT2单克隆抗体，其特征在于，其对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 6 或者 SEQ ID NO 7所示。
3.一种抗人PRRT2单克隆抗体，其特征在于，它由保藏号为CGMCC No.7810的杂交瘤细胞产生。
4.一种产生抗人PRRT2单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是分泌PRRT2抗体的小鼠骨髓瘤融合细胞株 9293-1hz-3P2，保藏号为CGMCC No.7810。
5.权利要求1所述的抗人PRRT2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
从PRRT2蛋白序列中选择1-6个肽片段作为抗原表位，通过接头将不同肽片段串联到一起；所述的抗原表位的序列选自SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条或者若干条；
合成抗原表位对应的目的cDNA序列，诱导表达串联多肽免疫原；
佐剂联合所述免疫原多点免疫小鼠，经细胞融合和筛选获得...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴志英，刘功禄，李宏福，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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