荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒制造技术

本发明专利技术利用探针荧光定量PCR技术，分2个体系能从临床样品中快速获取并检测出多种引起猪繁殖障碍和腹泻疾病的病毒，A体系检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)；B体系检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)。该检测试剂盒设计合理，使用方法简单，快速，准确，灵敏度高，适合于口岸检验检疫、畜牧业养殖、动物保护等部门使用，同时具有广泛的科研价值和商业前景。

【技术实现步骤摘要】
荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒
本专利技术提供一种多重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。 技术背景 每年的5月份至10月份，都会爆发一种以高热，呼吸困难，食欲下降，部分母猪流产、死产为特征的猪繁殖障碍性病。该病可传染各年龄段的猪，发病率高，死亡率随病程、继发感染发热严重程度不同而异，据估计，严重发病率群死亡率可达50%。该病来势凶猛，无特异防治方法，容易继发或并发其他病原微生物导致死亡，给养猪业造成巨大经济损失。猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine productiveand respiratory syndrome virus, PRRSV)、伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus, PRV)、猪痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)是与猪繁殖障碍密切相关的5种传染病病原菌。并且常常混合感染，有时又伴有细菌(如链球菌、胸膜肺炎放线杆菌)和血液原虫(如附红细胞体、弓形体)的并发或继发感染。还会导致腹泻等情况的发生。 猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是目前已知的最小的动物病毒。PCV分两个亚型，PCV-1型无致病性，PCV-2型感染主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)。PCV-2 感染与猪群中发生的许多新传染病密切相关，包括猪间质性肺炎、猪皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍以及仔猪先天性颤抖等，这些病总称为猪圆环病毒病(porcine circovirus associated diseases,PCVAD)。PCVAD作为一种新的病毒病在许多国家广泛流行，仅PMWS每年对欧洲养猪业造成的损失高达6亿欧元。目前，PCV-2感染在我国猪群中普遍存在，能够引起免疫抑制、混合感染和继发感染，严重危害养猪业的发展。 猪细小病毒(PPV)属于细小病毒科细小病毒属成员，是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一。PPV在世界各地普遍存在，可引起怀孕母猪流产、死胎、胎儿木乃伊化等，我国于20世纪80年代初在不同区分离得到了猪细小病毒，调查显示，绝大多数猪场均存在PPV的感染。近地年来，PPV感染呈扩大上升趋势，并呈现出许多新的流行特点，给养猪业造成巨大的经济损失。研究发现，该病毒除了能直接导致猪生殖缺陷外，还可在猪圆环病毒2型引起的断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的临床感染中扮演重要角色。 伪狂犬病病毒(PRV)属于疱疫病毒科α疱疫病毒亚科，可以感染多种家畜和野生动物。猪是PRV的天然宿主，感染后可引发母猪繁殖障碍，仔猪大量死亡，公猪失去种用能力等。根据不完全统计，全世界己有40多个国家和地区报道发生过本病，我国自1947年首次报道以来，现己扩展到全国二十几个省市，给我国畜牧业特别是养猪业造成了巨大的经济损失，目前本病己成为当前我国乃至世界各国猪病研究和防制的重点之一。 猪瘟病毒(CSFV)是猪瘟的病原，属于黄病毒科瘟病毒属成员。猪瘟是遍布于全世界性范围内的一种高度接触性传染病，早在19世纪初期就有关于猪瘟的报道，世界各国在对该病的防控上做出了巨大的努力，而且在北美、澳洲和北欧的一些地区曾成功地消灭了猪瘟，我国自20世纪20年代发生第I例猪瘟后，由于猪瘟兔化弱毒疫苗的广泛应用，已多年未大面积暴发猪瘟。但近年来，原已宣布消灭了猪瘟的欧洲一些国家又相继复发猪瘟，我国猪瘟的发病率亦呈上升趋势，且流行和发病特点发生了很大变化，呈非典型化态势，临床上主要表现为隐性带毒和慢性感染，成为影响养猪业发展的一大隐患，严重威胁着养猪业的发展。 猪蓝耳病，又称“猪繁殖与呼吸综合症”(PRRS)是由PRRSV引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸哀竭为主要症状的传染病，该病自20世纪80年代末期开始流行，遍布世界各个养猪国家，造成极大的经济损失。该病在我国普遍存在，且近年来呈流行态势。 以上5种病原均可不同程度地引起猪繁殖性障碍，并且常常混合感染。仅凭临床症状、病理变化、流行病学调查很难作出准确诊断，尤其是在发病的早期或潜伏期诊断更加困难，而且上述疾病的发生使对其它疾病如猪流行性腹泻的诊断变得复杂和困难。猪流行性腹湾(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹?写病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)引起猪的一种以呕吐、腹湾和脱水为主要特征的肠道传染病。该病以7日龄以内仔猪发病为主，病程短、传播迅速、仔猪死亡率极高，可达100%。1978年，比利时和英国首次报道PEDV疫情，1984年，我国证实该病的存在。在2010-2012年中国不同地区均有PEDV大暴发的报道，造成哺乳仔猪大量死亡，严重影响了我国养猪业的健康发展。因此，建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好、能同时检测多种病原的检测方法和检测试剂盒对猪呼吸和繁殖障碍疾病的诊断和防治具有重要意义。国内外兽医工作者建立了许多用于检测猪病原的方法，其中包括:电子显微镜技术、病毒分离培养试验、动物接种试验、免疫荧光试验、间接免疫荧光试验、各种免疫组织化学酶联免疫吸附试验(ELISA)方法、血清学诊断方法及原位杂交、聚合酶链式反应(Polymerase chain react1n, PCR)分子生物学方法等。对一个病原使用所有的诊断方法是不可行的，不同的病原需要使用最合适的诊断方法。但总的来说，上述这些方法都存在许多明显的不足之处，病毒分离耗时长，荧光抗体检测灵敏度不是很高，ELISA和血清学方法只能检测抗体，不适合早期诊断。实时荧光定量PCR (Real time fluorescent quantitative PCR, Real-time QPCR)技术自诞生之日起，就以其操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等众多优点，而被广泛应用于基础科学研究、药物研发、临床诊断、转基因研究、基因检测等各个领域研究当中，已经成为生命科学领域的一项常规技术。因此，基于多重荧光定量PCR技术建立起特异性强、灵敏度高、重复性好、能检测这6种病原的检测方法和检测试剂盒对猪繁殖障碍和腹泻疾病的诊断和防治具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能快速，准确性高，灵敏，经济的检测猪细小病毒PPV、猪流行性腹泻病毒PEDV、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV、伪狂犬病病毒PRV、猪瘟病毒CSFV、猪圆环病毒PCV等6种引起猪繁殖障碍或腹泻疾病的病毒的检测试剂盒。 为了解决上述技术问题，本专利技术针对各国的养猪业病毒感染的检测问题，提供了相应的检测试剂盒，包括能扩增100-200bp片段的引物，带有不同荧光基团的探针，A和B两个多重荧光TaqMan探针PCR扩增体系反应液，猪细小病毒PPV标准品、猪流行性腹泻病毒PEDV标准品、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV标准品、伪狂犬病病毒PRV标准品、猪瘟病毒CSFV标准品、猪圆环病毒PCV标准品，阴性对照品。 具体而言，本专利技术提供了荧光定量PCR检测猪本文档来自技高网...

【技术保护点】
荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒，其特征是包括如下2套体系：体系A，包括如下3对引物和如下对应的3条探针：一、上游引物PCV病毒—PR:5’‑CAGCACCCTGTAACGTTTGTC‑3’下游引物PCV病毒—PR:5’‑TTAGTCTTCCAATCACGCTTCTG‑3’特异性PCV病毒TaqMan荧光探针—P：5’‑HEX‑TTTCCCGCTCACGTTCAAAAGTTCAG‑BHQ1‑3’；二、上游引物PRV病毒—PR:5’‑CACGCCGATGTGGTGGA‑3’下游引物PRV病毒—PR:5’‑GGTACTGGCCCTCGTTGAA‑3’特异性PRV病毒TaqMan荧光探针—P：5’‑ROX‑ACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAG‑BHQ2‑3’；三、上游引物PPV病毒—PR:5’‑GCTTTAGCCTTGGAGCCGT‑3’下游引物PPV病毒—PR:5’‑AAGCAGGCTCTTATGTCGGTT‑3’特异性PPV病毒TaqMan荧光探针—P：5’‑FAM‑TGGAGCGAGCCAACAACACCAACTT–BHQ1‑3’；体系B，包括如下3对引物和如下对应的3条探针：一、上游引物CSFV病毒—PR:5’‑GCTCCCTGGGTGGTCTAAG‑3’下游引物CSFV病毒—PR:5’‑CTCGTCCACATAGCATCTCG‑3’特异性CSFV病毒TaqMan荧光探针—P：5’‑FAM‑CCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCG–BHQ1‑3’；二、上游引物PRRSV病毒—PR:5’‑TCAGCCATAGAAACCTGGAAAT‑3’下游引物PRRSV病毒—PR:5’‑ACGACAAATGCGTGGTTATCA‑3’特异性PRRSV病毒TaqMan荧光探针—P：5’‑HEX‑ACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTG C–BHQ1‑3’；三、上游引物PEDV病毒—PR:5’‑TGGCATTTCTACTACCTCG‑3’下游引物PEDV病毒—PR:5’‑AGTGGGTTCAGTCTTTGC‑3’特异性PEDV病毒TaqMan荧光探针—P：5’‑ROX‑CGAGTCCTATAACGGAGGTCGGCG–BHQ2‑3’。...

【技术特征摘要】
1.荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒，其特征是包括如下2套体系: 体系A，包括如下3对引物和如下对应的3条探针: 上游引物 PCV 病毒一PR: 5’ -CAGCACCCTGTAACGTTTGTC-3’ 下游引物 PCV 病毒一PR: 5’ -TTAGTCTTCCAATCACGCTTCTG-3’ 特异性 PCV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -HEX-TTTCCCGCTCACGTTCAAAAGTTCAG-BHQ1-3，；--、上游弓 I 物 PRV 病毒一PR: 5 ’ -CACGCCGATGTGGTGGA-3， 下游引物 PRV 病毒一PR: 5 ’ -GGTACTGGCCCTCGTTGAA-3， 特异性 PRV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -ROX-ACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAG-BHQ2-3，；__、 上游引物 PPV 病毒一PR: 5’ -GCTTTAGCCTTGGAGCCGT-3’ 下游引物 PPV 病毒一PR: 5 ’ -AAGCAGGCTCTTATGTCGGTT-3， 特异性 PPV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -FAM-TGGAGCGAGCCAACAACACCAACTT -BHQ1-3，； 体系B，包括如下3对引物和如下对应的3条探针: 上游引物 CSFV 病毒一PR: 5’ -GCTCCCTGGGTGGTCTAAG-3’ 下游引物 CSFV 病毒一PR: 5’ -CTCGTCCACATAGCATCTCG-3’ 特异性 CSFV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -FAM-CCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCG-BHQ1-3，；--、上游弓 I 物 PRRSV 病毒一PR: 5 ’ -TCAGCCATAGAAACCTGGAAAT-3 ’ 下游引物 PRRSV 病毒一PR: 5 ’ -ACGACAAATGCGTGGTTATCA-3， 特异性 PRRSV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -HEX-ACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGC-BHQ1-3，；__、 上游引物 PEDV 病毒一PR: 5’ -TGGCATTTCTACTACCTCG-3’ 下游引物 PEDV 病毒一PR: 5’ -AGTGGGTTCAGTCTTTGC-3’ 特异性 PEDV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -ROX-CGAGTCCTATAACGGAGGTCGGCG -BHQ2-3，。2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒，其特征是: 所述试剂盒还包括A和B两个多重荧光TaqMan探针PCR扩增体系反应液，猪细小病毒PPV标准品、猪流行性腹泻病毒PEDV标准品、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV标准品、伪狂犬...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜永厚，吴海港，饶品彬，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33