一种肌钙蛋白I致敏微球的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种肌钙蛋白I致敏微球的制备方法，其包括胶乳微球颗粒与亲和素结合，生物素与抗肌钙蛋白I抗体结合，联接乳胶和抗体等制备工序，本发明专利技术制备的肌钙蛋白I致敏微球在使用时可以提高临床检测肌钙蛋白I的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种肌钙蛋白I致敏微球的制备方法，其包括胶乳微球颗粒与亲和素结合，生物素与抗肌钙蛋白I抗体结合，联接乳胶和抗体等制备工序，本专利技术制备的肌钙蛋白I致敏微球在使用时可以提高临床检测肌钙蛋白I的灵敏度。【专利说明】一种肌钙蛋白I致敏微球的制备方法
本专利技术涉及一种高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球的制备方法。
技术介绍
肌钙蛋白是由3个亚单位，即肌钙蛋白C、肌钙蛋白I及肌钙蛋白T组成的复合物。肌钙蛋白(cTn)被认为是目前用于ACS诊断最特异的生化marker，它们出现早，最早可在症状发作后2h出现；具有较宽的诊断窗:cTnT (5?14天)，cTnl (4?10天)。在它们的诊断窗中，cTn增高的幅度要比CK-MB高5?10倍。由于在无心肌损伤时cTn在血液中含量很低，因此也可用于minor mycardial damage (MMD,微小心肌损伤)的诊断,这是以前酶学指标所难以做到的。cTn还具有判断预后的价值，对任何冠状动脉疾患病人，即便ECG或其他检查(如运动试验)阴性，只要cTn增高，应视为具有高危险性。 心肌肌I丐蛋白I(cardiac troponin I, CTnI)是一项新的心肌损伤的特异性和敏感性指标，同其它检测指标相比，CTnI在血液中出现早、持续时间长、特异性强，作为心肌轻度受损的指标，对急性心肌梗死(acute myocardial infarct1n, AMI)、不稳定型心绞痛(unstable angina Oectoris, UAP)、围手术期心肌损伤等疾病的诊断、病情监测、疗效观察及预后评估都具有较高的临床价值。 Tnl存在三种不同的亚基，即慢收缩骨骼肌Tnl、快收缩骨骼肌TnI和心肌收缩Tnl (CTnI)，分别有三种不同基因编码，快、慢收缩骨骼肌TnI与CTnI在氨基酸排列顺序上仅有4%相同，且后者比前者在N末端多31个氨基酸残基。前者分子量为19.8 kDa，后者为225 kDa，不同组织来源的TnI有组织特异性而无种属特异性，而CTnI仅存在于心房肌和心室肌中，且只有一种TnI存在，胎儿、新生儿及成年人各阶段的CTnI均相同，所以CTnI是一种理想的心肌细胞特异性标志。在心肌细胞膜完整时CTnI不能透过细咆膜进人血循环，当心肌细胞因缺血缺氧而发生变性坏死时，CTnI可通过破损的细胞膜弥散进人细胞间质，随之进人血管和淋巴管中。由于CTnI分子量较小，并持续从变性细胞内逸出，心肌损伤后CTnI3?6 h开始升高，14?20 h达高峰，血中可持续5?7天，故CTnI作为心肌损害的指标有较高特异性。 肌钙蛋白I (CTnI)检测方法主要有:放射免疫法(RIA)、酶免疫测定法(ELISA)、酶免疫化学发光法(CLIA)、胶乳增强免疫比浊法。现在放射免疫法存在辐射，酶免疫测定法灵敏度较差，而酶免疫化学发光法成本较高，所以胶乳增强免疫比浊法结合全自动生化分析仪进行检测的方法，最为常见。其原理为将特异性抗体结合于胶乳颗粒表面，制备致敏微球，样本与致敏微球颗粒在缓冲液中混合，样本中的TnI与致敏微球颗粒表面的抗体结合，使相邻的致敏微球颗粒彼此交联，在505nm波长下检测溶液浊度变化，变化程度与样本中的TnI含量成正比。 常规方法制备致敏微球颗粒的方式有物理吸附法和化学交联法，但是两种方法都会影响抗肌钙蛋白I (CTnI)抗体的免疫活性，而且一些非特异性吸附造成本底较大，严重影响了抗肌钙蛋白I (CTnI)抗体致敏微球的应用。
技术实现思路
针对于上述常规方法制备抗肌钙蛋白I (CTnI)抗体致敏微球颗粒方法存在的问题，本专利技术提供了一种高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球的制备工艺，应用本制备工艺获得的抗肌钙蛋白I抗体致敏微球作为原材料配制的肌钙蛋白I检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)，检测试剂的空白吸光度变化比常规的试剂要低，有利于提高临床检测肌钙蛋白I的灵敏度，与化学发光检测的结果具有高度的一致性(相关系数r > 0.990)，保证了试剂盒的准确度。 本专利技术是通过以下措施实现的:一种高活性肌钙蛋白I致敏微球的制备工艺，其操作流程如下:(O胶乳微球颗粒与亲和素结合:选择粒径为70-140nm的聚苯乙烯微球，均匀分散到pH为6.0-7.0的0.05M的MES缓冲液中，微球浓度为0.5-5%,加入亲和素，最终浓度为1-10%，在37°C恒温箱中震荡孵育2小时，用真空冷冻离心机离心，15000r/min离心20min，用浓度为0.05M，pH为7.4的PBS缓冲液进行分散，使结合了亲和素的胶乳微球颗粒浓度为 5%o ;(2)生物素与抗肌钙蛋白I抗体结合:将市购的抗肌钙蛋白I抗体用0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(pH 8.0)稀释到0.1-1 mg/mL，加入S-NHS生物素(羟基琥珀酰亚胺活化的生物素)100-1000 μ g，37°C恒温箱中震荡孵育2小时，后在4°C透析，以除去游离的生物素，用浓度为0.05M的PBS缓冲液(pH为7.4)进行分散，使结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体浓度为 10mg/L ；(3)联接乳胶和抗体:将结合了亲和素的胶乳微球颗粒(5%。)和结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体(10mg/L)悬浊液，按照1-5:10的体积比，加入到pH为6.0-7.0的0.05M的MES缓冲液中，在37°C恒温箱中震荡孵育4小时，用含lg/LBSA浓度为0.05M的PBS缓冲液(pH为7.4)进行分散，获得高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球。 本专利技术的有益效果:本专利技术提供的高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球的制备工艺，利用生物素-亲和素桥联接法原理，在聚苯乙烯微球表面结合一层亲和素，与被生物素标记的抗肌钙蛋白I抗体进行结合，形成抗肌钙蛋白I抗体致敏微球，由于生物素结合的抗体Fe端，不影响抗体活性端(Fab端)的活性，保证了制备的致敏微球活性高，而且采用桥联接法的方式，有效增大了致敏微球的比表面积，从而更容易结合肌钙蛋白I抗原，强化了免疫反应能力。应用本制备工艺获得的抗肌钙蛋白I抗体致敏微球作为原材料配制的肌钙蛋白I检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)，检测试剂的空白吸光度变化比常规的试剂要低，有利于提高临床检测肌钙蛋白I的灵敏度，与化学发光检测的结果具有高度的一致性(相关系数r > 0.990)，保证了试剂盒的准确度。 【专利附图】【附图说明】 图1为实施例1检测结果与化学发光检查结果的相关性图。 【具体实施方式】 为了更好的理解本专利技术，下面结合具体实施例来进一步说明。 实施例1(1)胶乳微球颗粒与亲和素结合:选择粒径为70nm的聚苯乙烯微球，均匀分散到pH为 6.0的0.05M的MES缓冲液中，微球浓度为0.5%。加入亲和素，最终浓度为1%，在37°C恒温箱中震荡孵育2小时。用真空冷冻离心机离心，15000r/min离心20min，去除有力的亲和素。用浓度为0.05M的PBS缓冲液(pH为7.4)进行分散，使结合了亲和素的胶乳微球颗粒浓度为 5%o ;(2)生物素与抗肌钙蛋白I抗体结合:将市购的抗肌钙蛋白I抗体用0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(pH 8.0)稀释到0.1 mg/mL，加入S-NHS生物素本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肌钙蛋白I致敏微球的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：（1）胶乳微球颗粒与亲和素结合：选择粒径为70‑140nm的聚苯乙烯微球，均匀分散到pH为6.0‑7.0的0.05M的MES缓冲液中，使微球浓度为0.5‑5%，加入亲和素，使浓度为1‑10%，在37℃恒温箱中震荡孵育2小时，用真空冷冻离心机离心，15000r/min离心20min，用浓度为0.05M， pH为7.4的PBS缓冲液进行分散，使结合了亲和素的胶乳微球颗粒浓度为5‰；（2）生物素与抗肌钙蛋白I抗体结合：将市购的抗肌钙蛋白I抗体用pH 8.0、浓度为0.1 mol/L 碳酸盐缓冲液稀释到0.1‑1 mg/mL，加入S‑NHS生物素100‑1000μg，37℃恒温箱中震荡孵育2小时，后在4℃透析除去游离的生物素，用浓度为0.05M的pH为7.4的PBS缓冲液进行分散，使结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体浓度为10mg/L；（3）联接乳胶和抗体：将结合了亲和素的胶乳微球颗粒和结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体悬浊液，按照（1‑5）:10的体积比，加入到pH为6.0‑7.0的0.05M的MES缓冲液中，在37℃恒温箱中震荡孵育4小时，用含1g/LBSA浓度为0.05M的pH为7.4的PBS缓冲液进行分散，获得高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谭柏清，王进，甘宜梧，王绮，李静，
申请(专利权)人：山东博科生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37