利用加热解决酶抑制法检测韭菜和蒜黄中农药残留的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用加热解决酶抑制法检测韭菜和蒜黄中农药残留的方法。该方法的实施步骤为：(1)制备试剂；(2)制备样品；(3)对照组处理；(4)韭菜或蒜黄处理；(5)检测结果计算。本发明专利技术通过在前处理过程中进行加热的方法，消除了使用酶抑制法检测韭菜和蒜黄样品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留产生假阳性的影响，具有快速、简便、准确和成本低的优点，更加适合于现场检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶抑制法检测蔬菜中农药残留的
，尤其涉及利用加热解决酶抑制法检测韭菜和蒜黄中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留产生假阳性的方法。
技术介绍
随着人们的生活水平不断提高和经济全球化日益突显，21世纪中国农业将由数量型向质量型转变，对农产品的安全生产和质量监控将更加严格。防止农药残留对人体的危害除了严格禁止高毒、高残留农药的使用和严格控制农药的用量外，加强对农药残留的快速检测也是控制农药使用的有效手段。近些年，随着农药残留检测技术的不断发展和加强监管力度，农药中毒事件已得到有效地控制。常用农药中，对高等动物毒性较大，容易引起中毒的是杀虫剂，而在杀虫剂中引起中毒事件最多的是有机磷和氨基甲酸酯类农药，且这两类农药在实际生产中使用频率较高，这就对有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速检测提出了更高的要求。目前，常用的有机磷和氨基甲酸酯类农药检测方法有气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法、酶抑制法等。其中，气相色谱法和液相色谱法定量准确，灵敏度高，但分析仪器昂贵，测定时间长，而且需要专业技术人员操作，是适用于实验室分析；薄层色谱法检测方法复杂，操作难度大；酶抑制法具有准确性高、检测速度快、操作简单、成本低等优点，适合现场快速检测，得到了广泛应用。酶抑制法检测蔬菜中农药残留的原理是：碘化硫代丁酰胆碱(BuTCI)在丁酰胆碱酯酶(BuChE)的作用下，被水解成硫代胆碱和丁酸，硫代胆碱可与二硫代双对基苯甲酸(DTNB)产生显色，使反应液呈黄色，在分光光度计410nm处有最大吸收峰，用分光光度计可测得酶活性被抑制程度(用抑制率表示)。在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对丁酰胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色过程发生改变，其抑制率与农药的浓度呈正相关。利用这一特性，在酶反应实验中加入底物和显色剂观察颜色的变化或测定酶与某种特定化合物反应的物理化学信号变化，可快速评估出蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留程度。但是，使用酶抑制法检测韭菜和蒜黄中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留时，会出现假阳性结果，干扰检测结果，造成误判。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有检测技术的不足，提供一种使用酶抑制法检测韭菜和蒜黄中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的方法，本专利技术是在酶抑制法的基础上进行改进，以消除韭菜和蒜黄在酶抑制法检测中出现假阳性，从而准确、快速地检测韭菜和蒜黄中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留。本专利技术解决使用酶抑制法检测韭菜和蒜黄中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留时，出现假阳性结果。本专利技术采用在前处理过程中加热的方法消除假阳性，从而快速、准确的检测。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：(1)制备试剂：①pH8.0缓冲液：准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)33.92g，磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.83g，用蒸馏水溶解定容至1000ml，即为pH8.0 0.1mol/L的磷酸缓冲液；②酶溶液：根据丁酰胆碱酯酶(BuChE)的活性情况，用10ml缓冲液溶解，反应前后吸光度差值ΔA0控制在大于或等于0.4；③底物液：碘化硫代丁酰胆碱(BuTCI)100mg，用10ml缓冲液溶解；④显色剂：二硫代双对基苯甲酸(DTNB)60mg，用10ml缓冲液溶解。(2)制备样品：称取切碎长度为1.0-1.5cm的韭菜或蒜黄2.0g，放入提取瓶内，加入20ml缓冲液，振荡1-2min，倒出提取液，静置3-5min，取上清液3ml于1支小试管中，在80℃的恒温箱或水浴锅中加热1min，冷却到室温，待用；(3)对照组处理：于1只提取瓶中加入20ml缓冲液，振荡1-2min，倒出提取液，静置3-5min。于小试管内分别加入50ul酶溶液，3ml提取液，50ul显色剂，在37-38℃的恒温箱中放置30min后，再加入50ul底物液，倒入比色皿中，用分光光度计检测在410nm波长下反应3min后与3min前的吸光度变化值ΔA0，记录数据；(4)韭菜或蒜黄处理：于步骤(2)中的1只小试管中加入50ul酶溶液，50ul显色剂，在37-38℃的恒温箱中放置30min后，再加入50ul底物液，倒入比色皿中，用分光光度计检测在410nm波长下反应3min后与3min前的吸光度变化值ΔA1，记录数据；(5)检测结果计算：酶抑制率(％)＝[(ΔA0ΔA1)/ΔA0]×100其中，ΔA0是对照组反应3min的吸光度变化值，ΔA1是样品组反应3min的吸光度变化值；当韭菜或蒜黄样品提取液对酶的抑制率≥70％时，表示该样品中含有某种有机磷或氨基甲酸酯类农药残留。当酶的抑制率≥70％时，该样品需要重复检测2次以上，几次重复检测的重现性应在80％以上，方可判定该样品检测呈阳性。对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确定具体农药品种及含量。步骤(1)的酶溶液置于-18℃冰箱中保存，缓冲液、底物液、显色剂置于0-5℃冰箱中冷藏保存、备用，保存期不超过两周。本专利技术的效果是，消除了利用酶抑制法检测韭菜和蒜黄中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的假阳性影响，是对酶抑制法检测蔬菜中农药残留的改进。经过对样品提取液加热处理后，假阳性现象得以消除。本专利技术提高和扩展了酶抑制法的适用范围和准确度，对利用酶抑制法进行现场检测蔬菜中农药残留具有推广意义。该专利技术可以快速、简便、准确地检测韭菜和蒜黄中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留，并且成本低廉，适用于现场快速检测。本专利技术的检测方法除对样品提取液进行加热处理外，其余步骤均与《NY/T 448-2001蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法》相同。具体实施方式实施例1加入已知农药标准溶液浓度的韭菜样品的检测(1)制备试剂：①pH8.0缓冲液：准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)33.92g，磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.83g，用蒸馏水溶解定容至1000ml，即为pH8.0 0.1mol/L的磷酸缓冲液；②酶溶液：根据丁酰胆碱酯酶的活性情况，用10ml缓冲液溶解，反应前后吸光度差值ΔA控制在大于或等于0.4；③底物液：碘化硫代丁酰胆碱(BuTCI)100mg，用10ml缓冲液溶解；④显色剂：二硫代双对基苯甲酸(DTN甲酸(DTNB)60mg，用10ml缓冲液溶解。(2)制备样品：称取2.0g切碎长度为1.0-1.5cm的韭菜7份，分别放入7个提取瓶内，添加不同浓度的农药标准溶液(已知浓度100ug/ml的甲胺磷、氧化乐果、克百威、涕灭威4种农药标准溶液，选取1中农药标准溶液分别加入5ul、10ul、20ul、30ul、40ul、50ul、60ul到步骤(2)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用加热解决酶抑制法检测韭菜和蒜黄中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留产生假阳性的方法，实施步骤如下：(1)制备试剂：①pH8.0缓冲液：准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)33.92g，磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.83g，用蒸馏水溶解定容至1000ml，即为pH8.0 0.1mol/L的磷酸缓冲液；②酶溶液：根据丁酰胆碱酯酶(BuChE)的活性情况，用10ml缓冲液溶解，反应前后吸光度差值ΔA0控制在大于或等于0.4；③底物液：碘化硫代丁酰胆碱(BuTCI)100mg，用10ml缓冲液溶解；④显色剂：二硫代双对基苯甲酸(DTNB)60mg，用10ml缓冲液溶解。(2)制备样品：称取切碎长度为1.0‑1.5cm的韭菜或蒜黄2.0g，放入提取瓶内，加入20ml缓冲液，振荡1‑2min，倒出提取液，静置3‑5min，取上清液3ml于1支小试管中，在80℃的恒温箱或水浴锅中加热1min，冷却到室温，待用；(3)对照组处理：于1只提取瓶中加入20ml缓冲液，振荡1‑2min，倒出提取液，静置3‑5min。于小试管内分别加入50ul酶溶液，3ml提取液，50ul显色剂，在37‑38℃的恒温箱中放置30min后，再加入50ul底物液，倒入比色皿中，用分光光度计检测在410nm波长下反应3min后与3min前的吸光度变化值ΔA0，记录数据；(4)韭菜或蒜黄处理：于步骤(2)中的1只小试管中加入50ul酶溶液，50ul显色剂，在37‑38℃的恒温箱中放置30min后，再加入50ul底物液，倒入比色皿中，用分光光度计检测在410nm波长下反应3min后与3min前的吸光度变化值ΔA1，记录数据；(5)检测结果计算：酶抑制率(％)＝[(ΔA0‑ΔA1)/ΔA0]×100其中，ΔA0是对照组反应3min的吸光度变化值，ΔA1是样品组反应3min的吸光度变化值；当韭菜或蒜黄样品提取液对酶的抑制率≥70％时，表示该样品中含有某种有机磷或氨基甲酸酯类农药残留。...

【技术特征摘要】
1.一种利用加热解决酶抑制法检测韭菜和蒜黄中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留产生假阳性的方法，
实施步骤如下：
(1)制备试剂：①pH8.0缓冲液：准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)33.92g，磷酸二氢钠
(NaH2PO4·2H2O)0.83g，用蒸馏水溶解定容至1000ml，即为pH8.0 0.1mol/L的磷酸缓冲液；②酶溶液：
根据丁酰胆碱酯酶(BuChE)的活性情况，用10ml缓冲液溶解，反应前后吸光度差值ΔA0控制在大于或等
于0.4；③底物液：碘化硫代丁酰胆碱(BuTCI)100mg，用10ml缓冲液溶解；④显色剂：二硫代双对基苯
甲酸(DTNB)60mg，用10ml缓冲液溶解。
(2)制备样品：称取切碎长度为1.0-1.5cm的韭菜或蒜黄2.0g，放入提取瓶内，加入20ml缓冲液，
振荡1-2min，倒出提取液，静置3-5min，取上清液3ml于1支小试管中，在80℃的恒温箱或水浴锅中加
热1min，冷却到室温，待用；
(3)对照组处理：于1只提取瓶中加入20ml缓冲液，振荡1-2min，倒出提取液，静置3-5min。于
小试管内分别加入50ul酶溶液，3ml提取液，50ul显色剂，在37-38℃的恒温箱中放置30min后，再加入
50ul底物液，倒入比色皿中，用分光光度计检测在410nm波长下反应3min后与3min前的吸光度变化值Δ
A0，记录数据；
(4)韭菜或蒜黄处理：于步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛科宇，张丽丽，
申请(专利权)人：薛科宇，张丽丽，
类型：发明
国别省市：河南;41