本发明专利技术提供一种新型的杂合抗菌抗病毒多肽，所述多肽的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和2所示。通过将编码所述多肽的基因克隆至表达载体pETSUMO，得到重组表达载体，然后通过热应激法转化入大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达，表达产物经SUMO蛋白酶酶切后经Ni-NTA Sepharose色谱柱纯化，分离获得目标多肽。所述多肽在体外对多种细菌、病毒均具有抑杀作用，且不易产生抗性，可作为理想的抗生素替代品和人畜生物性药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂等。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种新型的杂合抗菌抗病毒多肽，所述多肽的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ?ID?No.1和2所示。通过将编码所述多肽的基因克隆至表达载体pETSUMO，得到重组表达载体，然后通过热应激法转化入大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达，表达产物经SUMO蛋白酶酶切后经Ni-NTA?Sepharose色谱柱纯化，分离获得目标多肽。所述多肽在体外对多种细菌、病毒均具有抑杀作用，且不易产生抗性，可作为理想的抗生素替代品和人畜生物性药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂等。【专利说明】杂合抗菌抗病毒多肽、其制备方法及应用
本专利技术涉及基因工程及生物制药领域，具体地说，涉及一种新型的杂合抗菌抗病毒多肽、其制备方法及应用。
技术介绍
抗生素对于控制、预防和治疗各种感染性疾病具有重要作用。由于抗生素的使用，到20世纪80年代，人类几乎可以征服所有的感染类疾病，然而，随着时间的推移以及抗生素的滥用，耐药菌株愈来愈多。有监测发现，最具代表性的耐药菌株当中，耐药的葡萄球菌已上升至40% ;耐药的凝固酶阴性葡萄球菌则超过77%。现在，已经出现了能对抗所有抗生素的耐药菌，抗生素耐药问题已严重威胁到人类的健康。解除耐药菌对人类健康日益严重的威胁成为亟待解决的问题，因此新一类抗微生物物质的发现和研制已经成为国际上研究的热点。抗菌肽(Antimicrobial Peptides, AMPs)是由生物细胞特定基因编码,经特定外界条件诱导产生的一类分子量较小的活性多肽，一般由20~60个氨基酸残基组成，具有抗细菌、真菌、病毒、肿瘤、内毒素和原生动物的作用，并且具有刺激单核细胞和嗜中性粒细胞的趋化，促进创伤愈合等生物学活性。自上世纪70年代末Boman等首次从惜古比天蚕中发现天蚕素以来，抗菌肽因其独特的杀菌机制和优良的理化性质吸引了越来越多专家学者的关注，并已成为安全绿色抗生素添加剂替代品的理想选择，在畜牧业生产中具有广阔的应用前景。 蜂毒素(又称蜂毒溶血肽，Melittin,缩写ME)由26个氨基酸组成，相对分子质量2984道尔顿，不含二硫键，是蜂毒中的主要活性物质，具有抗菌、抗辐射和非常显著的抗炎镇痛作用。蜂毒素能够抑制20~30种革兰氏阴性及革兰氏阳性病原微生物的繁育，并能对抗对青霉素有耐药性的金黄色葡萄球菌。蜂毒素是迄今为止人类发现的抗炎活性最强的物质之一，其抗炎活性是氢化可的松的100倍。但溶血性严重，不能单独作为药物使用，因此需要将它与其他抗菌肽组合成新杂合肽使用。LL-37，相对分子质量约5000道尔顿，是迄今在人体中发现的抗菌肽(cathelicidin)家族中的唯一成员，也是人体内唯一具有双亲性α螺旋结构的抗菌肽。其广泛分布在人体的血液细胞和上皮细胞中，具有广谱抗菌作用。抗菌活性依赖其螺旋构象的形成，通过“地毯样”机制杀灭细菌。此外，LL-37还具有中和内毒素的作用，能与LPS和CD14结合，中和LPS的生物活性；利用FPRLl作为受体介导趋化作用，招募免疫细胞到感染部位，清除病原物；促进血管生成等作用。随着对抗菌肽结构、功能与杀菌机理研究的深入，研究人员开始尝试利用生物学方法设计杀菌活力更强、抗菌谱更广的新型抗菌肽。很多研究报道，将不同抗菌肽分子杂合是获得高抗菌活性低溶血性的新型抗菌肽分子的有效方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的杂合抗菌抗病毒多肽、其制备方法及应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术人在对蜂毒素和LL-37的序列、结构分析的基础上，进行杂合优化，获得一种新型的杂合抗菌抗病毒多肽，与母源肽(蜂毒素和LL-37)相比，除了具有更强抗菌作用外，还有抗病毒作用。所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第6位的Leu替换为He，或者在其末端缺失Leu Arg Asn三个氨基酸。因此，本专利技术的杂合抗菌抗病毒多肽还包括SEQ ID N0.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等功能的由SEQ ID N0.1衍生的多肽。为便于表述，将该多妝命名为M-L。本专利技术还提供编码所述杂合抗菌抗病毒多肽的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本专利技术还提供含有编码多肽M-L基因的载体。本专利技术还提供含有编码多肽M-L基因、或上述载体的宿主细胞、转基因细胞系及工程菌。可将编码多肽M-L的基因与表达载体可操作地连接，构建得到能够表达多肽M-L的重组表达载体，进而可以通过诸如热应激和电转化法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主细胞，得到转M-L基因的转化体，例如基因工程菌。本专利技术还提 供制备所述多肽M-L的方法，将构建的表达载体转化宿主菌，筛选阳性克隆，诱导表达目标多肽，并分离纯化表达产物。例如，将编码多肽M-L的基因克隆至表达载体pETSUMO，得到重组表达载体pETSUMO-M-L，通过热应激法转化入大肠杆菌BL21中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，表达产物经SUMO蛋白酶酶切后经N1-NTA Sepharose色谱柱纯化，分离获得目标多肽。具体地，制备所述杂合抗菌抗病毒多肽的方法包括如下步骤:1、重组大肠杆菌表达载体的构建:根据多肽M-L氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏好性，设计M-L基因序列，通过TA克隆与pETSUMO相连。转化大肠杆菌MachlTM-TlK，卡那霉素筛选阳性克隆子，构建该多肽的大肠杆菌表达载体pETSUMO-M-L。提取质粒，用特异性引物进行PCR验证，验证正确后进行测序鉴定。证实该杂合抗菌抗病毒多肽大肠杆菌表达载体pETSUMO-M-L构建成功。2、大肠杆菌的转化及筛选:重组质粒2μ I与200 μ I已活化大肠杆菌BL21感受态细胞混合，冰浴5-30 min,冰浴后42°C水浴热击30s (热击过程中切忌振荡)，然后迅速将混合液置于冰上，迅速加入250 μ I室温的LB培养基，37°C>200rpm振荡培养Ih ;培养后取200 μ I培养液涂布含50 μ g/ml卡那霉素的LB平板，然后倒置平板于37°C过夜培养。随机挑取生长出的大肠杆菌菌落于LB培养,按照LifeTechnologies公司质粒提取试剂盒的操作方法提取重组质粒，并以其为模板进行PCR扩增SUMO-M-L基因，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外光下可见约IlObp大小的明显条带，与SUMO-M-L基因的核苷酸序列大小一致，证明大肠杆菌高效表达菌株建立成功。3、诱导表达:挑选阳性克隆，接种于含50 μ g/ml卡那霉素和I %葡萄糖的LB培养基中，37°C、180-200rpm摇床培养至OD6tltl值为0.6-0.8时，加入IPTG溶液至终浓度1.5-2.0mM，继续培养，12000rpm离心5min，弃上清后-20°C保存。以未经诱导的菌液作为阴性对照。表达上清液于12000rpm离心10min收集菌体，根据菌体量加入约5倍体积的裂解缓冲液重悬细胞，吹打均匀，静置IOmin后，冰浴条件下超声破碎仪破碎菌体，破碎程序为:工作时长2s、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种杂合抗菌抗病毒多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张日俊，黄燕，武如娟，卫旭彪，赵龙妹，郑昭君，商婷婷，刘旭辉，马广，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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